Fermentative Herstellung spezifischer Gibberelline mit Fusarium fujikuroi

Abstract

Gibberelline sind natürlich vorkommende Phytohormone mit großem Einfluss auf das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen. Die kommerziell bedeutsamsten Gibberelline werden mithilfe des Pilzes Fusarium fujikuroi hergestellt. Die Charakterisierung der für die Gibberellinbiosynthese verantwortlichen Gene des Pilzes ermöglicht eine Manipulation des Gibberellinstoffwechsels, wodurch sich sowohl die Produktivität als auch das Produktspektrum des Pilzes verändern lassen. In dieser Arbeit wurden verschiedene Wildtypen und Mutanten von F. fujikuroi unter identischen Bedingungen im Bioreaktor miteinander verglichen: zwei GA3-produzierende Wildstämme, zwei GA7-produzierende Mutanten mit einer Ausschaltung des Gens P450-3 und zwei GA4-produzierende Mutanten mit einer Ausschaltung der Gene P450-3 und des. Dabei ergab sich abhängig vom jeweils produzierten Gibberellin ein anderer Verlauf der Gibberellinkonzentration, während sich andere Fermentationsparameter ansonsten gleich verhielten. Es zeigte sich, dass die Variation im Verlauf der Produktkonzentration auf unterschiedliches Zerfallsverhalten der einzelnen Gibberelline zurückführen ist. Das Zerfallsverhalten wurde in Abhängigkeit der Temperatur (20 bis 55 °C) und des pH-Wertes (pH 2 bis 9) untersucht und modelliert, wobei das Modell die Messdaten mit guter Übereinstimmung wiedergeben konnte. Unter Berücksichtigung der Zerfallskinetik zeigte sich, dass die Ausschaltung der Gene P450-3 und des keinen Einfluss auf die biomassespezifische Produktbildung hatte. Eine zusätzliche Ausschaltung des Gens ppt1 führte zu einer Ausschaltung verschiedener Nebenprodukte, was sich darin zeigte, dass sich die Kultur nicht verfärbte und der Masseanteil der Gibberelline im Rohextrakt höher war. Entgegen der Erwartung zeigten die Δppt1-Mutanten keine erhöhte Gibberellinbildung. Im Zentrum dieser Arbeit stand die Entwicklung eines mathematischen Modells, welches die Biomassebildung, den Glukose- und Stickstoffverbrauch, die Gibberellinbildung sowie die respiratorischen Raten Sauerstoffaufnahme und CO2-Bildung mit einem Bestimmtheitsmaß von über 0,79 wiedergibt. Das Modell wurde in dieser Arbeit zur Analyse der Fermentationsdaten verwendet und kann darüber hinaus zur Simulation der Fermentation unter veränderten Bedingungen eingesetzt werden. Im Anschluss an die Charakterisierung der verschiedenen Mutanten wurde der Einfluss der initialen Stickstoffkonzentration, der Temperatur, des pH-Werts, der Glukosekonzentration und der Sauerstoffsättigung untersucht. Innerhalb des untersuchten Arbeitsbereichs stellten sich lediglich die Stickstoffkonzentration zu Beginn der Fermentation und der pH-Wert als signifikante Prozesseinflüsse heraus. Die initiale Stickstoffkonzentration war direkt proportional zur Konzentration an aktiver Biomasse, während sich die spezifische Gibberellinbildung als unabhängig von der initialen Stickstoffkonzentration erwies. Daraus folgt, dass die maximale Gibberellinkonzentration mit steigender Konzentration an initialem Stickstoff ansteigt. In Abhängigkeit vom pH-Wert zeigte die spezifische Produktbildungsrate ein Optimum bei pH 3,5. Da sich das Zerfallsverhalten der verschiedenen Gibberelline stark voneinander unterscheidet, muss bei der Optimierung des pH-Werts die Abhängigkeit der Zerfallsgeschwindigkeit vom pH-Wert unbedingt berücksichtigt werden. Zuletzt erfolgte eine Untersuchung des Fermentationsverhaltens unter Steady-State-Substrat¬limitation der Kohlenstoff- und Stickstoffquelle. Unter C-Limitation wurde etwa ein Drittel weniger Glukose verbraucht und nahezu keine Speicherstoffe ins Myzel eingelagert. Allerdings war die Gibberellinbildung deutlich reduziert. Durch den Einsatz einer exponentiellen Fed-Batch Fahrweise unter Stickstofflimitation war es möglich, die Wachstumsrate zu steuern. Fünf verschiedene Wachstumsraten wurden eingestellt. Die Untersuchung ergab, dass die spezifische Produktivität mit steigender Wachstumsrate abnimmt.