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Authors: Gomes da Costa, Stefan
Title: Hyperspectral coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging
Issue Date: 2019 Dissertation vi, 168
Abstract: The optical analysis of microscopic samples has a long history, and many different microscopy techniques evolved through the years. While many of the optical microscopy methods provide destruction-free and noninvasive investigation of the samples, if not only morphological information is desired, its combination with optical spectroscopy techniques provide additional chemical information of the sample. Among the chemical specific optical spectroscopies, the most sensitive technique is based on fluorescence spectroscopy, which takes advantage of chemically specific labeling of the sample with fluorophores. In contrast, vibrational spectroscopies allow for its label-free investigation, among which Raman spectroscopy is one of the most versatile methods for the extraction of intrinsic molecular structure information about the sample. In addition to high chemical specificity, it provides high spatial resolution when performed in a confocal microscope. However, as the spontaneous Raman effect is weak, often long integration times are needed, and its signal may often be overwhelmed by fluorescence in various samples. Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) circumvents these limitations by adding a second excitation field, coherently exciting the molecular vibrations, which are probed by a third field. The resulting CARS emission is generated on the anti-Stokes side of the excitation wavelengths, avoiding the impact of one-photon induced fluorescence background, when compared to spontaneous Raman detection. Moreover, its coherent amplification provides about three orders of magnitude higher detection sensitivity, and its multi-photon nature provides intrinsic three-dimensional sectioning capability in optical microscopy. The first implementation of CARS in a microscopy setup reported by Xie and coworkers in 1999 [1] has started a new interest in the coherent Raman technique as a powerful noninvasive optical tool for fast label-free chemical imaging based on the intrinsic vibrational contrast of the sample and providing insights of the molecular composition within microscopic samples. Beyond single-resonance CARS detection, an experimental realization of probing the contiguous Raman range over 4000 cm−1 for each image pixel is required. In this thesis, a novel concept of hyperspectral CARS imaging is introduced, which relies on the generation of broadband Stokes pulses in a photonic-crystal fiber (PCF) with a spectral width and energy density which are adequate for efficient CARS excitation. For the successful realization of this concept, first the following questions had to be answered: What PCF-generated supercontinuum (SC) pulse allows hyperspectral CARS generation with both high spectral resolution and high signal-to-noise ratio? Furthermore, what is the best experimental solution for the direct measurement of both amplitude and phase of a broadband field under tightly focused excitation laser beam conditions? As the hyperspectral CARS generation is dependent on the interaction of a single pair of a narrowband pump and a broadband Stokes pulse in the sample, it is important to investigate the generation of the broadband CARS field on a singlepulse level, which cannot be done experimentally. In chapter 5 the hyperspectral CARS generation with ps-seeded SC pulses is therefore simulated to identify the ideal Stokes pulse for a given PCF design. By simulating the phase and amplitude for the broadband PCF seeded SC, and consecutively for the broadband complex CARS field generated with these single SC fields, single-pulse broadband CARS spectra are characterized, which has not been reported in the literature yet. Seed pulse lengths in the fs- and ps-regime are investigated, obtaining non-compressible single SC spectra covering the full Raman shift range needed for subsequent hyperspectral CARS generation. Considering the spectral resolution, with a bandwidth matching that of a typical vibrational resonance, the covered spectral Raman-shift range, the CARS signal-to-noise ratio (SNR), and the simplest experimental implementation, the use of a single laser oscillator, providing 2:94-ps seed-pulses proved to be the best choice. Based on the simulation results, the concept of all-ps hyperspectral CARS imaging with 2:94-ps pulses was developed and an experimental setup was subsequently realized, which are described in detail in chapter 6. Picosecond Hyperspectral CARS imaging is then successfully demonstrated and characterized by investigating two exemplary samples, which both strongly benefit from avoiding the intrinsic fluorescence background. First, samples of primordial broth from a Miller-Urey (MU) experiment are studied in order to gain more insight into their complex and unknown molecular composition and chemical structure in a non-invasive way. Depending on the initial conditions in the MU experiment, molecules with a higher degree of aromaticity, or a higher amount of nitriles and aliphatic C-H compounds, were identified by broadband CARS spectroscopy, which could not be detected by conventional Raman spectroscopy because of the presence of a strong fluorescence background. The assignment of the characteristic peaks to aromatic CxNy ring structures indicates the presence of nucleic acids, which find supporting evidence in the corresponding UVVIS absorption spectra. In the second demonstration of the novel concept, the all-ps hyperspectral CARS imaging is then experimentally applied to the 2D and 3D mapping of chemical and structural properties of molecules inside a single pollen grain. Here, the advantage of the coherent enhancement of the samples intrinsic Raman response in hyperspectral CARS is exploited, performing fast and label-free imaging of a biologically relevant example of a plant cell with unknown composition. The spectral fingerprints of the various biological constituents within their sub-cellular structures are revealed within a sub-micron focus spot. Simultaneous 3D hyperspectral CARS and 2PF volumetric and quantitative imaging of an entire single daisy pollen grain was successfully demonstrated, where in total 950400 spectra were acquired within 127 minutes. The multivariate analysis of the recorded hyperspectral data set has enabled an evaluation without a priori knowledge of the sample. As a result, the exine, the pollen plasma, and both pollen nuclei, were visualized based on their characteristic spectral Raman signatures of phenolic biopolymers, proteins, and nucleic acids, respectively. Hyperspectral CARS imaging is a coherent technique where a coherent enhancement of the CARS field generated in the sample is possible by interference with an external local oscillator (LO) field. In chapter 7, a new approach to interferometric hyperspectral CARS imaging is realized, where broadband phase-correlated signal and idler photon pairs are produced in a PCF by picosecond-seeded broadband spontaneous FWM, which provide the LO field and the Stokes fields, respectively. The temporal delay between the LO field and the CARS field from the sample enables the full control over their phase relation, and hence provides the most general approach to interferometric hyperspectral CARS imaging. This direct experimental access to the phase and amplitude of the CARS field allows the extraction of the complex vibrational response of the samples third order nonlinear susceptibility χ(3)(ν), which is in contrast to the standard hyperspectral CARS imaging approach, where the phase needs to be estimated posterior to the measurements. The proof of this novel concept of interferometric hyperspectral CARS imaging is experimentally demonstrated for a single microscopic droplet of benzaldehyde. After performing hyperspectral CARS imaging exclusively in the frequency domain, in chapter 8 the time domain is added. By exploiting the characteristic of CARS being a Raman pump-probe technique, where the probe pulse is delayed with respect to the pair of temporally overlapped pump and Stokes pulses, the implementation of time-resolved multiplex (2D) CARS enables the measurement of the dephasing times of all spectrally resolved Raman coherences simultaneously. Here, 2D-CARS microspectroscopy with a ps- and a near transform-limited few-cycle fs-pulse has been successfully applied to a neat toluene test sample within a sub-femtoliter probe volume. The Raman free induction decay (RFID) constants of various vibrational modes of toluene were extracted from the analysis of their simultaneously recorded CARS intensity time-profiles. As such, for the first time we were able to spectrally separate the 1000 cm−1 and the 1019 cm−1 modes in time resolved 2D-CARS microspectroscopy. For the application of CARS microscopy in the life sciences, it is often not possible to measure in transmission due to scattering and absorption of the excitation fields inside a thick sample. Therefore it is often indispensable to collect the generated CARS in a epi-detection geometry. In most previous studies on epi-detected CARS microscopy, the back-reflection of forward scattered CARS (F-CARS) from the sample is giving the strongest epi-detected CARS signal contribution. For a complete experimental characterization and better understanding of intrinsic episcattered CARS (E-CARS), the back-reflection of the F-CARS from the sample needs to be separated or better eliminated. In chapter 9, a very thin PMMA polymer sample of continuously varying thickness was introduced for the first systematic and quantitative experimental study of intrinsic broadband E-CARS emission. Pure broadband E-CARS spectra were measured, providing simultaneously both resonant and non-resonant E-CARS from a microscopic sample, which could not be measured by conventional F-CARS microspectroscopy. The fact, that the full broadband ECARS spectrum is measured allows the evaluation of the origin of different E-CARS signal contributions and therefore their comparison with previous simulations. For the first time, the theoretically predicted oscillatory behavior of pure E-CARS signal in dependence of the sample thickness was experimentally and quantitatively verified for the full spectrum.
Optische Analysen mikroskopischer Proben blicken auf eine lange Historie zurück, in der viele verschiedene Mikroskopietechniken über die Jahre hinweg entwickelt würden. Viele der optischen Mikroskopie-Methoden ermöglichen eine zerstörungsfreie und nicht-invasive Untersuchung der Proben. Sind bei dieser Untersuchung nicht nur rein morphologische Informationen erwünscht, können durch die Kombination mit optischen Spektroskopietechniken zusätzliche chemische Informationen über die Probe gewonnen werden. Die sensitivste unter den chemisch-spezifischen, optischen Mikroskopiemethoden basiert auf der Fluoreszenzspektroskopie, für die die chemisch-spezifische Fluoreszenzmarkierung der Proben genutzt wird. Im Gegensatz dazu ermöglichen Schwingunsspektroskopien eine markierungsfreie Untersuchung der Proben, unter denen die Raman-Spektroskopie zu den vielseitigsten Methoden zur Bestimmung von intrinsischen, molekularen Strukturinformationen der Probe zählt. Zusätzlich zu einer hohen chemischen Spezifizität bietet die Raman-Spektroskopie unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops eine hohe räumliche Auflösung. Da jedoch der Raman-Effekt sehr schwach ist, werden häufig lange Integrationszeiten benötigt. Zudem ist das Raman-Signal oft von Fluoreszenz der Probe überdeckt. Über die kohärente anti-Stokes Raman-Streuung (engl.: Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS)) können diese Limitierungen unter Verwendung eines zweiten Anregungsfeldes umgangen werden, da eine kohärente Anregung der molekularen Schwingungen erfolgt, und diese im Folgenden von einem dritten Feld abgefragt wird. Die resultierende CARS-Emission wird auf der anti-Stokes-Seite der Anregungswellenlängen erzeugt, wobei der Einfluss des Ein-Photon-induzierten Fluoreszenzhintergrundes - im Vergleich zu der spontanen Raman Detektion - vermieden wird. Zusätzlich dazu führt die kohärente Verstärkung zu einer Messsensitivität, die um drei Größenordnungen höher liegt. Außerdem führt die Multi-Photonen-Eigenschaft zu einem intrinsischen, drei-dimensionalen Auflösungsvermögen in der optischen Mikroskopie. Die erste, durch Professor Xie und Kollegen in 1999 [1] präsentierte, Umsetzung von CARS in einem Mikroskopie-Aufbau hat ein neues Interesse an der CARS-Methode als ein leistungsfähiges, nichtinvasives, optisches Werkzeug für die schnelle, markierungsfreie, chemische Bildgebung geweckt. Die Methode basiert auf einem intrinsischen Schwingungskontrast der Probe und erlaubt einen Einblick in die molekulare Zusammensetzung mikroskopischer Proben. Über die Detektion einzelner CARS-Resonanzen hinaus wird eine experimentelle Realisierung der Messung eines zusammenhängenden Raman-Spektralbereichs von über 4000 cm-1 für jeden einzelnen Bildpunkt benötigt. In dieser Doktorarbeit wurde ein neues Konzept der hyperspektralen CARS-Bildgebung eingeführt, welche auf der Erzeugung breitbandiger Stokes-Pulse mit einer, für eine effiziente CARS-Anregung adäquaten, spektralen Breite und Energiedichte in einer photonischen-Krsitallfaser (engl.: Photonic Crystal Fiber (PCF)) basiert. Für die erfolgreiche Umsetzung dieses Konzepts mussten zunächst folgende Fragen beantwortet werden: Welche PCF-erzeugten Superkontinuumspulse (SC) ermöglichen eine hyperspektrale CARS-Erzeugung mit hoher spektraler Auflösung und mit hohem Signal-zu-Rausch-Verhältnis? Was ist außerdem die beste experimentelle Lösung für die direkte Messung der Amplitude und der Phase eines stark fokussierten, breitbandigen elektromagnetischen Feldes? Da die hyperspektrale CARS Erzeugung von der Interaktion einzelner Paare von schmalbandigen Pump und breitbandigen Stokes-Pulsen in der Probe abhängt, war es wichtig, die breitbandige CARS Generierung für einzelne Pulse zu untersuchen, was experimentell nicht möglich ist. In Kapitel 5 wurde daher zunächst die hyperspektrale CARS Erzeugung mit ps-induzierten SC-Pulsen simuliert, um damit die idealen Stokes-Pulse für das gewählte PCF-Design zu bestimmen. Durch die Simulation der Phase und Amplitude des breitbandigen, PCF-erzeugten SC sowie durch die anschließende äquivalente Simulation für das mit diesen SC-Feldern erzeugte, breitbandige, komplexe CARS Feld wurden einzelne, breitbandige CARS-Pulse charakterisiert, wozu es bisher keine Veröffentlichungen gibt. Anregungspulslängen im fs- und ps-Bereich wurden untersucht, wodurch nicht komprimierbare, einzelne SC-Pulse erzeugt wurden, die den gesamten Raman-Spektralbereich abdecken, der für die anschließende hyperspektrale CARS-Erzeugung benötigt wird. In Anbetracht des abgedeckten Raman-Spektralbereichs, des CARS Signal-zu-Rausch-Verhältnisses (engl.: signal-to-noise-ratio (SNR)), der einfacheren experimentellen Umsetzung und der spektralen Auflösung mit einer spektralen Bandbreite, die mit typischen Schwingungsresonanzen übereinstimmen, stellte sich ein 2,94 ps Puls als bester Anregungspuls heraus. Auf den Simulationsergebnissen basierend wurde das Konzept für eine ps-hyperspektrale CARS- Bildgebung mit 2,94 ps Anregungspulsen entwickelt und ein experimenteller Aufbau realisiert, welcher in Kapitel 6 im Detail beschrieben wird. Anschließend wurde eine pikosekunden-hyperspektrale CARS-Bildgebung erfolgreich an zwei exemplarischen Proben angewandt und charakterisiert. Die Messungen beider Proben profitierten stark von der Vermeidung des intrinsischen Fluoreszenzhintergrundes. Zunächst wurden Ursuppenproben, die von einem Miller-Urey-Experiment (MU) stammen, untersucht, um ein weiteres Verständnis ihrer komplexen und unbekannten, molekularen Zusammensetzung und chemischen Struktur auf eine nicht-invasive Weise zu erlangen. In Abhängigkeit der Anfangsbedingungen der MU-Experimente wurden Moleküle mit einer höheren Anzahl aromatischer, beziehungsweise einer höheren Anzahl von Nitril und aliphatischen C-H Verbindungen durch breitbandige CARS-Spektroskopie identifiziert. Aufgrund des starken Fluoreszenzhintergrundes konnte hier nicht mit spontaner Raman-Spektroskopie gemessen werden. Die Zuordnung der charakteristischen Peaks zu den aromatischen CxNy Ringstrukturen deuten auf die Präsenz von Nukleinsäuren hin, was durch ergänzende UVVIS-Absorptionspsektroskopie untermauert wurde. In der zweiten Anwendung des neuen Konzepts wurde die ps-hyperspektrale CARS-Bildgebung zur experimentellen, chemischen 2D- und 3D-Kartierung der chemischen und strukturellen Eigenschaften von Molekülen innerhalb eines einzelnen Pollenkorns demonstriert. Hierbei wurde der Vorteil der kohärenten Verstärkung der intrinsischen Raman-Antwort der Probe durch hyperspektrales CARS ausgenutzt, um eine schnelle, markierungsfreie Bildgebung einer biologischen Probe einer Pflanzenzelle mit unbekannter Zusammensetzung zu erzeugen. Mit einer sub-Mikrometer-Auflösung wurde der spektrale Fingerabdruck der zahlreichen, unterschiedlichen, biologischen Komponenten in der intrazellulären Struktur enthüllt. Die beiden gleichzeitigen, quantitativen und volumetrischen 3D-hyperspektrale CARS und 2PF-Bildgebungen eines gesamten, einzelnen Gänseblümchen-Pollenkorns wurde erfolgreich demonstriert, wobei insgesamt 950400 Spektren in 127 Minuten aufgenommen wurden. Die multivariate Analyse des aufgenommenen hyperspektralen Datensatzes erlaubt die Auswertung der Daten ohne vorherige Kenntnisse der Probe. Als Ergebnis wurden das Pollenplasma, beide Pollenkerne und die Exine anhand ihrer jeweils charakteristischen spektralen Signaturen von Proteinen, Nukleinsäuren sowie eines phenolisches Biopolymers visualisiert. Die hyperspektrale CARS-Bildgebung ist eine kohärente Methode, die eine kohärente Verstärkung des in der Probe erzeugten CARS-Feldes durch die Interferenz mit einem externen, lokalen Oszillator- (LO-) Feld ermöglicht. In Kapitel 7 wurde ein neuer Ansatz für eine interferometrische, hyperspektrale CARS-Bildgebung realisiert, bei der breitbandige, phasen-korrelierte, sogenannte Signal- und Idler-Photonenpaare, in einer PCF erzeugt wurden, die durch pikosekunden-gepumpte, breitbandige, spontane, Vier-Wellen-Mischung (engl.: Four-Wave-Mixing (FWM)) erzeugt und für den interferometrischen CARS-Prozess das LO- und das Stokes-Feld bereitgestellt wurden. Die zeitliche Verzögerung zwischen dem LO- und dem CARS-Feld der Probe ermöglichte die volle Kontrolle über deren Phasenbeziehung und stellte somit den vielfältigsten Ansatz für interferometrische, hyperspektrale CARS-Bildgebung dar. Dieser direkte, experimentelle Zugang zur Phase und Amplitude des CARS-Feldes ermöglichte die direkte Bestimmung des komplexen Schwingungsverhaltens der nichtlinearen Suszeptibilität dritter Ordnung χ(3)(ν) der Probe. Im Gegensatz dazu musste zur standard-hyperspektralen CARS-Bildgebung die Phase nachträglich zur Messung bestimmt werden. Der experimentelle Nachweis dieses neuen Konzeptes der interferometrischen, hyperspektralen CARS-Bildgebung wurde an einem einzelnen, mikroskopischen Benzaldehyd-Tropfen durchgeführt. Nach der exklusiven Anwendung der hyperspektralen CARS-Bildgebung in der Frequenzdomäne wurde in Kapitel 8 die Zeitdomäne hinzugefugt. Die Charakteristik von CARS als eine Raman-Pump-Probe-Technik wurde hierbei ausgenutzt, wobei der Abfragepuls zu dem zeitlich überlappten Paar von Pump- und Stokes-Pulsen verzögert ist. Dadurch sollte die Implementierung von zeitaufgelösten, multiplex-(2D-) CARS die Messung der Dephasierungszeiten von allen spektral aufgelösten Raman-Kohärenzen gleichzeitig ermöglichen. Hier wurde 2D-CARS mit einem ps- und einem nah-transform-limitierten, wenige Schwingungen zählenden, fs-Puls erfolgreich an einer reinen Toluol Test-Probe in einem sub-Femtoliter Probenvolumen angewendet. Die freien Raman-Induktionszerfallskonstanten (engl.: Raman free induction decay (RFID)) von zahlreichen Schwingungsmoden von Toluol wurden durch die Analyse ihrer zeitgleich aufgenommen CARS-Intensitätszeitprofile extrahiert. Unter anderem waren wir in der Lage, zum ersten Mal die Schwingungsmoden bei 1000 cm-1 und 1019 cm-1 in zeitaufgelöster 2D-CARS Mikrospektroskopie spektral aufzulösen. Für die Anwendung von CARS in den Lebenswissenschaften ist es oft aufgrund von Streuung und Absorption der Anregungsfelder in dicken Proben nicht möglich, in Transmission zu messen. Daher ist es häufig unerlässlich, das erzeugte CARS in einer epi-Detektionsgeometrie zu sammeln. In den meisten vorhergehenden Studien zu epi-detektierter CARS-Mikroskopie trägt die Ruckreflektion des vorwärtsgestreuten CARS (F-CARS) der Probe den größten Anteil zum epi-detektierten CARS-Signal bei. Für eine komplette, experimentelle Charakterisierung und ein besseres Verständnis des intrinsisch rückgestreuten CARS (engl.: epi-scattered CARS (E-CARS)) muss das von der Probe rückreflektierte F-CARS getrennt oder besser vermieden werden. In Kapitel 9 wurde für die erste, systematische und quantitative, experimentelle Studie intrinsischer breitbandiger E-CARS-Emission eine sehr dünne PMMA-Probe mit sich kontinuierlich ändernder Dicke eingeführt. Reine, breitbandige E-CARS Spektren wurden aufgenommen, wobei simultan das resonante und nichtresonante E-CARS von einer mikroskopischen Probe gemessen wurde, was mit konventioneller F-CARS-Mikrospektroskopie nicht möglich war. Die Tatsache, dass das gesamte, breitbandige E-CARS Spektrum gemessen wurde, ermöglicht die Beurteilung des Ursprungs verschiedener E-CARS-Signalbeiträge und somit deren Vergleich mit vorhergehenden Simulationen. Zum ersten Mal wurde hier das theoretisch vorhergesagte, oszillatorische Verhalten des E-CARS-Signals in Abhängigkeit der Probendicke für das gesamte Spektrum experimentell und quantitativ nachgewiesen.
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