Kopplung von Aldolasereaktionen und der Thiamindiphosphat-abhängigen Synthase MenD zur Gewinnung funktionalisierter Feinchemikalien

Abstract

Die Knüpfung intermolekularer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen (C C Bindungen) und die Spaltung von C C Bindungen haben in vielen Stoffwechselwegen eine wichtige Bedeutung. Die Kohlenstoffkette verlängernde enzymkatalysierte Carboligationsreaktionen finden darüber hinaus in der Biokatalyse breite Anwendung. In der vorliegenden Arbeit wurden durch Aldolasen und durch das Thiamindiphosphat-(ThDP)-abhängige Enzym MenD katalysierte Reaktionen kombiniert, um hochfunktionalisierte Produkte zu erhalten. Im ersten Schritt wurde durch die Aldolasen Eda bzw. DgoA aus 50 mM Pyruvat (7) und 100 mM Glyoxylat (8) 4-Hydroxy-2-oxoglutarat (HOG, 2) gebildet. Beide Enzyme zeigten Umsätze von > 99% (Eda) bzw. von > 90% (DgoA). Die Bildung des Produktes 2 wurde für beide Aldolasen durch LC-MS-Analyse und die Struktur mittels 1H-NMR-Spektroskopie bestätigt. Mit Circulardichroismus wurde gezeigt, dass DgoA zu einem höheren Enantiomerenüberschuss der Produkte führt als Eda. Das enzymatisch gebildete HOG (Eda) (2a) bzw. HOG (DgoA) (2b) wurde zusammen mit verschiedenen Akzeptorsubstraten und MenD inkubiert. Der Umsatz der MenD-Reaktionen wurde als Abnahme des jeweils eingesetzten Akzeptorsubstrates definiert. Für die Ein-Topf-Reaktionen mit 2a bzw. 2b wurden zu dem oben beschriebenen Assay für die Gewinnung von 2a bzw. 2b zusätzlich 20 mM Akzeptorsubstrat und 0.7 mg/mL MenD hinzugefügt. MenD zeigte für die Kontrollreaktion des physiologischen Donors 2 Ketoglutarat (1) an 2,3 CHD (3) eine Abnahme des Akzeptorsubstrates von 90%. Für die 1,4 Addition von 2a an 3 wurde eine Abnahme für 3 von 78% bestimmt, die höher lag als für 2b mit 23%. Sowohl LC-MS-Messungen als auch aufgenommene 1H-NMR-Spektren zeigten, dass das jeweils aus 2a bzw. 2b und 3 gebildete 2-Malyl-5,6-dihydroxycyclohexen-1-carboxylat (MDHCHC) zu Iso MDHCHC isomerisiert, wie es durch Kurutsch et al. (2009) entsprechend für die 1,4-Addition von 1 an 3 zu 2-Succinyl-5,6-dihydroxycyclohexen-1-carboxylat (SDHCHC) bzw. Iso SDHCHC beschrieben wurde. 1H-NMR-Messungen und 1D-Tocsy-Experimente bestätigten die Decarboxylierung von 2a und die anschließende 1,4 Addition an den Cyclohexadienring von 3 unter Ausbildung eines Cyclohexenringes. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass neben 1 sowohl 2a als auch 2b als Donor für die 1,4 Addition mit Acrylsäure (4) als aliphatischem Akzeptor dienen können. Die Abnahmen des Akzeptors waren jeweils > 99% und die Produktbildung wurde mittels LC-MS bestätigt. Die 2-Stufen-Synthese bestehend aus der Bildung von 2a bzw. 2b und deren 1,4-Addition an 3 bzw. 4 konnte auf die 1,2 Addition an den aromatischen Akzeptor Benzaldehyd (5) als auch an den aliphatischen Akzeptor Hexanal (6) übertragen werden. Für die 1,2-Addition an 5 als Akzeptor lag die Substratabnahme für 1, 2a und 2b jeweils > 99% und Produktbildung wurde in allen drei Fällen mit Hilfe von LC-MS und 1H-NMR-Spektroskopie bestätigt. Produktbildung wurde auch für die 1,2-Addition von 1 als Positivkontrolle (Abnahme des Akzeptorsubstrates: 95%) und 2a bzw. 2b an 6 mittels LC-MS bestätigt. Die Abnahme des Akzeptorsubstrates 6 war für 2a mit 87% bzw. für 2b mit 62% niedriger. Das Wildtypenzym MenD ist wie viele ThDP-abhängige Enzyme spezifisch für die (R) Konfiguration der 2-Hydroxyketon-Produkte. Um Produkte mit einer gewünschten Stereokonfiguration zu erhalten, wurde für die 1,2-Addition von 1 an 5 die (S)-selektive MenD-Variante MenD_I474A_F475G (Westphal et al., 2013a) eingesetzt (Abnahme von 5: 86%). Ebenso wurden für 2a bzw. 2b als Donorsubstrate Abnahmen des Akzeptors 5 von 94% (2a) bzw. 89% (2b) gezeigt. Außerdem wurde für diese MenD-Variante gezeigt, dass sie die 1,2 Addition der Donorsubstrate 1 (91%), 2a (63%) bzw. 2b (40%) an 6 katalysiert. Die Produktbildung wurde für alle sechs Produkte mit Hilfe von LC-MS bestätigt. Auf diesen Ergebnissen aufbauend wurde MenD_I474A_F475G in der vorliegenden Arbeit erstmals für 1,4 Additionsreaktionen eingesetzt. Es wurde die Eignung dieser Variante für die 1,4-Addition gezeigt, die Abnahme des Akzeptors betrug für die 1,4-Addition von 1 und 4 > 99%. Darüber hinaus akzeptiert diese MenD-Variante auch 2a und 2b als Substrat für die 1,4 Addition an 4 (Substratabnahme für 2a: 76% bzw. für 2b: 76%). Zudem wurden weitere Akzeptorsubstrate (Salicylaldehyd, 3-Formylchromon und 2 Amino-3 formylchromon) und Monocarbonsäuren (2-Ketobutyrat und 3-Methyl-2-ketobutyrat) als Donoren für MenD eingeführt. Auf Grund der fehlenden Carboxylgruppe ist die Stabilisierung der Monocarbonsäuren schlechter als die des pyhsiologischen Donors 1. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe von Enzymreaktionen funktionalisierte Substrate hergestellt, die als Donoren für MenD dienen. Nachdem 2 als neuer Donor für MenD eingeführt werden konnte, könnte diese 2-Stufen-Synthese in andere Stoffwechselwege von Bakterien integriert werden.