EPIC’RISPR: a modular and inducible platform for highly parallel synthetic epigenetics and chromatin imaging in a high-throughput format

Abstract

The epigenome describes the sum of epigenetic states in an organism. It consists of biochemical modifications of the DNA and histone proteins, non-coding RNAs and the three-dimensional architecture of the genome. These modifications and structures regulate the genome expression in a cell-type-specific pattern and hence control the development of the whole organism. Research in this field yielded a lot of descriptive information about the correlation between epigenetic marks and gene expression. Unfortunately, we do not know much about the causalities within the epigenetic network. With the discovery of the groundbreaking CRISPR/Cas9 technology, it is now possible to interfere with the epigenetic program. This methodology, which is known as epigenetic editing, allows the recruitment of effector molecules to distinct targets where they introduce or remove specific modifications. By observing the response of the epigenome, we can conclude how the epigenetic network functions. However, this system is somewhat limited regarding the simultaneous modification of multiple loci, which is a necessity for investigating a network. In this thesis, I combined the targeting and recruiting functionality of the CRISPR/Cas9 system in one molecule, the gRNA. Like this, this EPIC’RISPR platform can recruit numerous effector molecules to one or multiple targets simultaneously without interference. I demonstrated this by activating and repressing three target genes with different effector domains at once and by recruiting different fluorophores to several target loci. I further applied this technology to perturb five differently expressed target genes simultaneously with one effector molecule at a time. For this, I performed a large-scale experiment in which I probed the effects of more than 60 epigenetic effector molecules on target gene transcription. I identified several promising candidates which might exhibit synergistic behaviour and hence a stronger and longer-lasting impact on the epigenetic program. Furthermore, I developed ON- and OFF-switches for the EPIC’RISPR system which utilize small molecules to fine-tune the introduced effects arbitrarily. The OFF-switch was further applied for transgene expression control, extending the functionality of this system even further. Additionally, our group developed protocols for the synthesis and functionalisation of paramagnetic beads and their application in the automated high-throughput extraction of nucleic acids. Since its publication, our platform, which we call Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB) has since become a hub for collaborations in open-source science, especially during the COVID-19 pandemic.

Das Epigenom beschreibt die Gesamtheit der epigenetischen Zustände in einem Organismus. Es besteht aus den biochemischen Modifikationen der DNA und der Histon-Proteine, nicht-kodierenden RNAs und der dreidimensionalen Architektur des Erbguts. Diese Modifikationen und Strukturen steuern die Expression des Genoms in zelltyp-spezifischen Mustern und kontrollieren daher die Entwicklung des gesamten Organismus. Die diesbezügliche Forschung erbrachte hauptsächlich beschreibende Informationen über die Korrelation von epigenetischen Modifikationen und Genexpression. Leider ist bis heute wenig über die kausalen Zusammenhänge im epigenetischen Netzwerk bekannt. Mit der Entdeckung der bahnbrechenden CRISPR/Cas9 Technologie is es heute allerdings möglich, das epigenetisch Programm gezielt zu stören. Diese Methode, welche auch als Epigenetische Editierung bekannt ist, erlaubt es Effektormoleküle gezielt an spezifische Gene zu dirigieren, wo sie Modifikationen setzen oder entfernen können. Indem anschließend die Reaktion des Epigenoms beobachtet wird, können Rückschlüsse auf die Funktionsweise des epigenetischen Netzwerkes gezogen werden. Dieses System ist jedoch recht limitiert in Bezug auf die simultane Modifikation mehrerer Zielgene, was jedoch eine Notwendigkeit bei der detaillierten Untersuchung von Netzwerken darstellt. In dieser Arbeit kombinierte ich die beiden Funktionen der Zielbestimmung sowie der Rekrutierung auf einem Molekül des CRISPR/Cas9 Systems, der gRNA. Auf diese Weise ist die EPIC’RISPR Plattform in der Lage mehrere Effektormoleküle zeitgleich an ein oder mehrere Ziele zu rekrutieren, ohne dass diese miteinander interferieren. Ich wies dies nach, indem ich zum einen zeitgleich drei Zielgene aktivierte oder reprimierte und zum anderen indem ich mehrere Fluorophore an verschiedene Orte im Erbgut dirigierte. Ich verwendete diese Technologie außerdem dazu fünf verschieden stark exprimierte Gene simultan mit einem Effektormolekül zu beeinflussen. Dafür führte ich ein Experiment durch, in welchem ich die Auswirkungen von mehr als 60 epigenetischen Effektormolekülen auf die Expression der Zielgene untersuchte. Dabei identifizierte ich mehrere vielversprechende Kandidaten, welche potenziell synergistische und damit stärkere und langanhaltendere Wirkung auf das epigenetische Programm haben könnten. Des Weiteren entwickelte ich EIN- und AUS-Schalter für das EPIC’RISPR System, welche kleine Moleküle verwenden um die eingeführten Effekte in ihrer Stärke beliebig zu steuern. Der AUS-Schalter kann außerdem auch für die Expressionskontrolle von Transgenen verwendet werden, was die Funktionalität des Systems noch weiter ausdehnt. Zusätzlich entwickelte unsere Arbeitsgruppe Protokolle für die Synthese und Funktionalisierung von paramagnetischen beads, sowie für deren Anwendung zur automatisierten Extraktion von Nukleinsäuren im Hoch-Durchsatz-Verfahren. Seitdem unsere Plattform, welche wir Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB) nennen, veröffentlicht wurde, ist sie zu einem Dreh- und Angelpunkt für quelloffene Wissenschaft geworden, insbesondere während der COVID-19 Pandemie.