Gewinnung und Charakterisierung biogener Azid-modifizierter extrazellulärer Matrix als click-chemisch vernetzbares Biomaterial

Abstract

Unter dem Begriff „clickECM“ wird eine biogene, d. h. eine von in vitro kultivierten Fibroblasten gebildete, extrazelluläre Matrix (engl. extracellular matrix, ECM) verstanden, die sich durch das Vorhandensein von abiotischen Azidgruppen für click-chemische Vernetzungsreaktionen auszeichnet. Dadurch vereinen diese Materialien vorteilhafte nutzbare bioaktive Eigenschaften der natürlichen biogenen ECM mit spezifischer chemischer Reaktivität. Sie ermöglichen über die niedermolekularen funktionellen Azidgruppen die selektive Konjugation dieser biomakromolekularen Materialien in einer bioorthogonalen Azid-Alkin-Cycloaddition mit verschiedenen Alkin-funktionalen Molekülen. Das Ziel dieser Arbeit bestand in der effizienten Gewinnung und umfangreichen Charakterisierung solcher biogenen clickECM für die Anwendung als Biomaterial. Dabei wurde zunächst das bestehende Verfahren zur Isolation und Aufarbeitung der clickECM mit einem Aufkonzentrierungsschritt auf Basis der Mikrozentrifugation erweitert. Dadurch wurde gegenüber dem bisherigen Verfahren die ECM-Konzentration um das ca. 20-fache gesteigert. Durch den mechanischen Krafteintrag eines Kugelmühlen-Homogenisators ließ sich die aufkonzentrierte clickECM zuverlässig homogenisieren, sodass die entstehenden clickECM-Suspensionen Fragmentgrößen im Bereich von ca. 8 - 31 µm aufwiesen und reproduzierbar verarbeitet werden konnten. Die Proteinstrukturen sowie die Azide der clickECM wurden dabei nicht geschädigt. In umfassenden Untersuchungen wurden unterschiedliche Methoden zur Charakterisierung der biomolekularen Zusammensetzung des Materials evaluiert. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese sowie (immun)histochemische Färbemethoden in Kombination mit verschiedenen mikroskopischen Techniken wurden als geeignete qualitative Methoden identifiziert. Kommerziell erhältliche kolorimetrische Protein-Assays wurden umfassend evaluiert und als nicht geeignet für die zuverlässige Quantifizierung der clickECM-Proteinkonzentration bewertet. Es wurde eine verlässliche Methode etabliert, in der der Stickstoffgehalt zunächst durch eine Elementaranalyse quantifiziert und dann mithilfe spezieller Umrechnungsfaktoren in den Gesamtproteingehalt umgerechnet werden konnte. Dieser lag im Bereich von ca. 54 - 61 %(w/w). Durch Quantifizierung und Umrechnung des Hydroxyprolingehalts mittels geeigneter Umrechnungsfaktoren konnte die Menge an unlöslichem Kollagenen auf ca. 19 - 25 %(w/w) bestimmt werden. Der SircolTM-Assay zur Quantifizierung löslicher Kollagene ergab, dass diese in der clickECM nicht nachgewiesen werden konnten, während mithilfe des BlyscanTM-Assays der Gehalt an sulfatierten Glykosaminoglykanen auf ca. 3 %(w/w) bestimmt werden konnte. Es zeigte sich, dass das Metabolische Glykoengineering mit peracetyliertem N-Azidoacetylgalactosamin die Konzentration an unlöslichem Kollagen in der clickECM im Vergleich zur unmodifizierten ECM signifikant erhöhte. Alle anderen Messwerte unterschieden sich nicht voneinander. Angewandt als Oberflächenbeschichtung war es möglich, homogene und bioaktive Beschichtungen mit einer mittleren Schichtdicke von ca. 31 µm zu erzeugen, die die darunterliegende Oberfläche vollständig bedeckten und stabil gegen fluidmechanischen Abrieb waren. Durch Konjugation der clickECM-Azide in diesen Schichten mit Alkin-gekoppelten Biotin-Molekülen konnten die Schichten erfolgreich biotinyliert werden, um basierend auf der vielseitigen Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung eine universelle Biokonjugationsplattform aufzubauen. Auf diese Weise gelang es, die clickECM-Schichten mit zusätzlichen, nicht natürlicherweise in der ECM vorkommenden Funktionen wie der Meerrettichperoxidase auszurüsten. Unter Verwendung von Azid-modifizierter Gelatine (clickGel) als Modellsubstanz für die clickECM wurden bioaktive Hybridhydrogele aus Polyethylenglykol-Diacrylat (PEG-DA) generiert. Um ein Auswaschen der clickGel aus dem Polymernetzwerk zu verhindern, konnten die Azide mit dem heterobifunktionalen Linker N-Propargylacrylamid konjugiert und anschließend im Zuge der Vernetzungsreaktion anhand der photopolymerisierbaren Gruppen kovalent im Hydrogelnetzwerk verankert werden.