Modellierung der Adsorption von Proteinen an Oberflächen

Abstract

Die Adsorption von Proteinen an Oberflächen ist ein äußerst komplexer Prozess, der in vielen Bereichen, wie der Medizin, Pharmazie, Nanotechnologie und Biotechnologie, von großer Bedeutung ist. In der vorliegenden Arbeit wurden computergestützte Methoden zur Vorhersage der Orientierung und des Bindungsverhaltens von Proteinen bei der Adsorption entwickelt. Die Arbeit konzentrierte sich hierbei auf die Gebiete der Ionenaustauschchromatografie, der hydrophoben Interaktionschromatografie und der Immobilisierung. Als untersuchte Proteine wurden Hühnereiweiß-Lysozym, die Hämdomäne der bakteriellen Cytochrom P450-BM3 Monooxygenase und humane monoklonale Antikörper verwendet. Lysozym gehört zu den am besten charakterisierten und meisten analytisch verwendeten Proteinen, da es billig und in großen Mengen hergestellt werden kann. Viele bisherige Untersuchungen wurden mit Lysozym durchgeführt und die adsorbierte Orientierung auf Kationenaustauschern konnte experimentell bestimmt werden. Der Adsorptionsvorgang von Cytochrom P450-BM3 ist von Interesse bei Immobilisierungen, welche zu verbesserten Eigenschaften bei Betrieb und Lagerung sowie zu einer einfachen Separation des Produkts führen. Wichtig ist hierbei eine Orientierung des Enzyms mit freiliegendem Substratzugang. Auch bei der Bindung auf beschichteten Elektroden, durch welche sich die Möglichkeit der Entwicklung analytischer und biokatalytischer Anwendungen sowie eine einfache und billige Elektronenquelle ergibt, ist die Orientierung wichtig. Ebenso wie der Substratzugang ist hier die korrekte Orientierung des elektronenakzeptierenden Bereichs wichtig, da dieser mit der Elektrodenoberfläche in Kontakt stehen sollte. Antikörper gehören zu den am häufigsten eingesetzten therapeutischen Proteinen. Ihre Produktion ist teuer, da sie meist über Protein A aufgereinigt werden. Es besteht großes Interesse an billigeren alternativen Verfahren, wie der Ionenaustauschchromatografie.

Früher wurden Adsorptionsprozesse meist mit vereinfachten Modellen eines Proteins, beispielweise als kugelförmiges Gebilde, modelliert. Durch die zunehmende Aufklärung der Proteinstrukturen in atomarer Auflösung wurden auch weiter entwickelte Adsorptionsmodelle erstellt, jedoch wurden Proteine dabei meist als unflexible Objekte modelliert.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es durch ein unflexibles Modell des Proteins, abhängig von der verwendeten Struktur und dem Abstand zur Oberfläche, bei der Modellierung von Adsorptionen zu Abweichungen von der experimentell bestimmten Orientierung kommen kann. Eine grobe Abschätzung der Bindungsorientierung ist bei einem kurzen Abstand aber noch möglich. Durch multiple Molekulardynamische Simulationen (MD-Simulationen), in welchen das Protein frei und flexibel an die Oberfläche binden konnte, hat sich am Beispiel Lysozym gezeigt, dass der Mittelwert der festgestellten gebundenen Orientierungen mit der experimentell bestimmten Orientierung, unabhängig von der zu Beginn verwendeten Proteinstruktur, übereinstimmte.

Im Vergleich zeigten verschiedenen Proteine auch ein unterschiedliches Bindungsverhalten. Während bei Lysozym die Simulationen über einer negativ geladenen Oberfläche nur ein ähnliches Bindungsverhalten mit ähnlichen Bindungsorientierungen zeigte, erfolgte die Bindung der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne auf einer positiv geladenen Oberfläche aufgrund ihres starken Dipolmoments immer in gleicher Weise und mit gleicher Orientierung. Die Orientierung der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne in der frühen Phase der Bindung konnte auch mittels der rigiden Bestimmungsmethode festgestellt werden. Ein Kippen der kompletten Proteinstruktur nach dem ersten Kontakt zur Oberfläche wurde jedoch nur mittels MD-Simulationen vorhergesagt. Es konnte am Modell gezeigt werden, dass die adsorbierte Orientierung auf einer positiv geladenen Oberfläche zu einer Beeinträchtigung des Substratzugangs führt und, im Falle der Immobilisierung auf einer positiv geladenen Adsorberoberfläche, welche beispielsweise bei beschichteten Elektroden eingesetzt wird, eine ungünstige Ausgangsorientierung für die Elektronenübertragung vorliegt.

Mittels MD-Simulationen der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne über verschiedenen Anionenaustauscherliganden konnte eine Korrelation der Bindungsenergien bei verschiedenen Salzkonzentrationen mit experimentell gemessenen chromatografischen Daten bestimmt werden.

MD-Simulationen mit Antikörper waren durch die rechenintensiven, langreichweitigen Wechselwirkungen zwischen Adsorber und Protein im Rahmen der zur Verfügung stehenden technischen Möglichkeiten nicht durchführbar. Es konnten dennoch die Regionen, die bei der Aufreinigung mittels Ionenaustauschchromatografie Einfluss auf die Retention nehmen und somit für eine Optimierung des Proteins für den Aufreinigungsprozess infrage kommen, beispielsweise durch gezielte Mutationen in diesem Bereich, an der Proteinoberfläche mittels eines starren Modells bestimmt werden.

The adsorption of proteins at surfaces is a very complex process. It is of great importance in different fields like medicine, pharmacy, nanotechnology and biotechnology. In the present paper computer aided methods for predicting the orientation and binding behavior of proteins during adsorption processes have been developed. It is focused on the areas of ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and immobilization. The proteins hen egg white lysozyme, cytochrome P450-BM3-heme domain, and monoclonal antibodies were analyzed. Lysozyme is one of the best characterized and most analyzed proteins because its low costs and availability in huge amounts. Many previous analyses have been made using lysozyme and it was possible to obtain an adsorbed orientation on a cation exchanger experimentally. The adsorption process of cytochrome P450-BM3 is of great interest in the area of immobilization, especially on electric surfaces which offer the possibility of developing analytical and biocatalytic applications. The correct orientation is of great importance on a cathode surface as the substrate channel has to be accessible and the electron accepting area should be in contact with the surface. Antibodies belong to the most applied therapeutic proteins. The production is extremely expensive as purification is done via protein A. The interest in cheap alternative processes like ion exchange chromatography is given.

In former times adsorption processes were modelled by simplified protein models, for example spherical shapes. With the increasing number of solved protein structures in atomic resolution further developed models of adsorption processes have been established, though proteins have only been treated rigidly, so far.

In this paper it could be shown that the use of rigidly treated proteins may lead deviations of the experimentally determined orientation depending on structure and distance to the surface. By the use of MD-simulations in which the protein was able to bind free and flexible to the surface the example of lysozyme showed that slight changes of the protein structure during the adsorption process may lead to different orientations on the adsorber. The average of all simulated orientations equalled the experimentally determined orientation independent of the used protein structure.

The used proteins showed a very different binding behavior in comparison. The cytochrome P450-BM3 heme domain bound in an identical orientation on positively charged surfaces in all simulations due to its strong dipole moment. It was also possible to obtain this orientation by rigid modeling methods. However, an additional tilting at the surface could only be shown by MD-simulations. It was demonstrated that the adsorbed orientation at positive charged surfaces leads to a covering of the substrate channel. The immobilization on positive charged surfaces which are used for enzyme coated cathodes leads to a disadvantageous arrangement of the electron accepting area on the surface. Additionally, a correlation was found between the computed binding energies and experimentally determined chromatographic retentions at different salt concentrations.

MD-Simulations of antibodies with long-range interactions are too time consuming at the moment. Nevertheless, it could be shown by rigid orientation detection methods which regions of the protein surface have influence at purification processes and could be relevant for an optimization.