Gid4p, the regulatory unit of a novel E3 ubiquitin ligase involved in carbohydrate metabolism in yeast

Abstract

The nutrient glucose is a major component influencing gene expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Hence, cells grown on a nonfermentable carbon source undergo important metabolic changes when glucose is added to the media. Among the important changes occuring, the gluconeogenetic enzymes are inactivated and degraded to ensure a full efficiency of glycolysis in a process termed catabolite inactivation or catabolite degradation. The fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) has long been used as a model to study this phenomenon. The activity of this enzyme decreases rapidly once glucose is provided to the cells. This diminution is due to a two-step process where the enzyme is first inactivated by a phosphorylation of its serine 11 residue, the second step consists of the degradation of FBPase. This last step has been found to depend both on the vacuole or the proteasome, depending on the starvation conditions used before the media is supplemented with a fermentable sugar. The focus of our laboratory is set upon the proteasomal-dependent event. A genome-wide screen for deletion mutants which would lead to a stabilization of FBPase upon glucose treatment unraveled 9 so-called GID genes. Among these genes, GID3 and GID6 were found to be identical to UBC8 and UBP14, respectively. Ubc8p is an ubiquitin-conjugating enzyme, already implicated in the proteasomal breakdown of the FBPase. The lack of Ubp14p, on the other hand, has been shown to lead to a stabilization of certain proteasomal substrates, probably because unanchored polyubiquitin chains cannot be cleaved to their single moieties, which might lead to a competition between these chains and bona fide proteasomal substrates. The seven remaining genes were further characterized and found to be part of a so-called GID complex. Interestingly, three of these genes are also involved in the vacuolar-dependent degradation of FBPase. A recent work demonstrated that three members of the GID complex are necessary for the polyubiquitination of FBPase prior to its degradation by the proteasome. However, no ubiquitin ligase could be associated with this polyubiquitination event. It was therefore postulated that the GID complex itself bears an ubiquitin ligase activity. The discovery of a "degenerated" RING domain in Gid2p substantiated this hypothesis. Hence a mutation in this RING domain leads to a impairment of the polyubiquitination of FBPase. The focus of this study is set upon the Gid4p subunit of the Gid complex which, like the other Gid subunits, is necessary for the degradation of FBPase but also of PEPCK to occur. The N-terminal epitope tagging of Gid4p allowed its detection and outlined the peculiarities of Gid4p compared to the other Gid proteins. Gid4p is the only subunit that is not expressed in ethanol-growing cells. It becomes detectable shortly after the cells are provided with glucose or other fermentable sugars. Cycloheximide treatment confirmed that this de novo biosynthesis of Gid4p is necessary for the degradation of FBPase. This raises the possibility that Gid4p acts as a molecular switch to trigger the change from gluconeogenesis to glycolysis. Indeed, the forced expression of GID4 gene in gluconeogenetic cells leads to a destabilization of FBPase. This result is further underlined by the fact that Gid4p is also essential to allow the polyubiquitination of FBPase. How Gid4p activates the Gid complex is still an open question: glycerol step gradients performed with lysates from gluconeogenetic or glycolytic cells did not reveal any change in the distribution of Gid1-HA3 or Gid7-HA3. The same experiment performed with a GID4 deleted strain confirmed this result. After 30 minutes of shift onto glucose, the steady state levels of Gid4p begin to diminish. As other ubiquitin ligase subunits are degraded by the enzyme they belong to, it was postulated that this was also the case for Gid4p. Indeed, deletion of GID2, UBC8 or the inhibition of the proteasome by MG132 lead to a stabilization of Gid4p. Altogether, this work shows that an intact RING domain is necessary for Gid2p to be able to polyubiquitinate the FBPase. Furthermore, it sheds light on the role played by Gid4p within the Gid complex and shows that it is a major regulator of the ubiquitin ligase activity of this complex.

Der Nährstoff Glucose ist ein wichtiger Signalgeber der Genexpression in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Zellen, die auf einer nicht-fermentierbaren Kohlensoffquelle wachsen, sind erheblichen Stoffwechseländerungen ausgesetzt, sobald Glucose dem Medium zugesetzt wird. Beispeihaft für diese Änderungen ist das Schicksal der Gluconeogenetischer Enzyme, deren Aktivität herabgesetzt wird und die eventuell zusätzlichProteinabbau unterliegen. Hierbei bezeichnet man die Inaktivierung der Enzyme als Katabolitinhibition. Dieser Vorgang sichert eine effiziente Umschaltung von Gluconeogenese zur Glycolyse. Schon seit langem ist das Schlüsselenzym der Gluconeogenese, die Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase), Gegenstand von Untersuchungen zur Katabolitinaktivierung. Wird Glucose zu auf nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquellen kultivierten Zellen hinzugefügt, führt dies zum Verlust der Enzymfunktion: mittels Phosphorylierung und Inhibitoren wird die Enzymaktivität gehemmt. Im Anschluß daran folgt der Abbau des Proteins. Bislang wurden zwei mögliche Degradationswege der FBPase beschrieben, zum einen über die Vakuole, ein der Autophagie ähnliches Ereignis, zum anderen durch das Proteasom. Welcher der beiden Prozesse letztendlich greift, hängt von den Hungerbedingungen der Hefezellen vor Glucosegabe ab. In unserem Labor steht der proteasomale Abbau im Fokus. In einem genomweiten Screen wurden neun GID (glucose induced degradation deficient) Gene identifiziert, deren Nullmutationen zur Stabilisierung von FBPase führen, nachdem die Zellen von nicht-fermentierbarem Medium auf glucosehaltiges Medium transferiert wurden. Zwei dieser Gene, GID3 und GID6, konnten als die schon bekannten Gene UBC8 und UBP14 identifiziert werden. Ubc8p ist ein Ubiquitinkonjungierendes Enzym und ist bezüglich der Polyubiquitinierung der FBPase besonders wichtig. Der beobachtete Effekt von einer Deletion von UBP14 beruht auf der Anreicherung freier Ubiquitinketten, die in direkte Konkurrenz mit den substratgebundenen Ubiquitinketten um die Ub-Bindestellen am Proteasom treten. Die sieben verbleibenden GID Gene wurden ebenfalls untersucht und wurden einem gemeinsamen Komplex zugehörig gefunden, dem GID-Komplex. Interessanterweise sind einige der GID Gene auch im vakuolären Abbauprozess der FBPase involviert. Drei Gid proteine sind für die Polyubiquitinierung der FBPase unabdingbar. Da keine bekannte Ubiquitin-Ligase am Abbau der FBPase beteiligt zu sein scheint, wurde vermutet, dass diese Aufgabe möglicherweise dem GID-Komplex zukommt. Die Entdeckung einer „degenerierteng RING Domäne in Gid2p untermauerte diese Hypothese. Mit Hilfe einer Mutation in dieser RING Domäne konnte gezeigt werden, dass diese Domäne für die Polyubiquitinierung der FBPase notwendig ist. Im Fokus dieser Arbeit steht Gid4p, eine Untereinheit des GID-Komplexes, die wie die anderen Gid Proteine für den FBPase Abbau notwendig ist, allerdings auch einen Einfluß auf die Degradation von Phosphoenolpyruvatcarboxykinase (PEPCK) hat. Die N-terminale Markierung von Gid4p mit dem Myc Epitop erlaubte ihren Nachweis. Als einzige Untereinheit des GID-Komplexes ist Gid4p in Zellen die in Ethanol gewachsen sind nicht exprimiert. Erst kurz nach Zugabe eines anderen fermentierbaren Zuckers zum Wachstumsmedium ist Gid4p nachweisbar. Behandlung der Zellen mit Cycloheximid zeigte, dass die de novo Biosynthese von Gid4p für den FBPase Abbau notwendig ist. All diese Befunde bestätigen die Annahme, dass Gid4p ein molekularer Schalter ist, der die Umschaltung von Gluconeogenese zur Glucolyse einleitet. Wird Gid4p in gluconeogenetischen Zellen exprimiert, resultiert dies in einer verkürzten Halbwertszeit der FBPase. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Gid4p, wie auch Gid1p und Gid7p, für die Polyubiquitinierung der FBPase essentiell ist. Wie Gid4p den GID-Komplex aktiviert, bleibt noch zu klären; ein mit gluconeogenetischen und glycolytischen Hefezelllysaten durchgeführter Glycerolgradient konnte keine Unterschiede in der Massenverteilung von Gid1-HA und Gid7-HA aufdecken. Eine ähnliches Ergebnis konnte mit einer Deletion von GID4 wiederholt werden. Nach 30 Minuten auf Glucose nimmt die Expression von Gid4p ab. Da verschiedene Untereinheiten von Ubiquitin-Ligasen in Abhängigkeit ihres eigenen Proteinkomplexes abgebaut werden, wirft das die Frage auf, ob dieser Befund auch für Gid4p zutrifft. Tatsächlich führen Nullmutationen von UBC8 und GID2 zur Stabilisierung von Gid4p. Des weiteren wird Gid4p vom Proteasom abgebaut, da die Blockade des Proteasoms durch den Inhibitor MG132 in einer Stabilisierung von Gid4p resultiert. Diese Arbeit zeigt die Notwendigkeit der degenerierten RING Domäne in Gid2p für die in vivo Polyubiquitinierung der FBPase. Weiterhin decken die gezeigten Ergebnisse die Funktion von Gid4p innerhalb des GID Komplexes auf und verdeutlichen, dass Gid4p den hauptsächlichen Regulator der Ubiquitin-Ligaseaktivität darstellt.