Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.18419/opus-1258
Authors: Barbin, Lise
Title: Ubiquitin-proteasome dependent catabolite degradation of fructose-1,6-bisphosphatase : localization and involvement of novel components
Other Titles: Ubiquitin-Proteasom abhängige Katabolitdegradation der Fructose-1,6-bisphosphatase : Lokalisierung und Beteiligung von neuen Komponenten
Issue Date: 2010
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-50250
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/1275
http://dx.doi.org/10.18419/opus-1258
Abstract: In the yeast Saccharomyces cerevisiae, when cells are grown on a on-fermentable carbon source like ethanol, the key regulatory gluconeogenic enzyme fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) is synthesized. Addition of glucose to the medium leads to a quick change from gluconeogenesis to glycolysis. FBPase is then rapidly inactivated by phosphorylation, polyubiquitinated and degraded by the 26S proteasome. Prior to proteasomal degradation, polyubiquitination of the enzyme occurs via the ubiquitin-conjugating enzymes Ubc1, Ubc4, Ubc5 and Ubc8 in conjunction with a novel multi-subunit ubiquitin ligase, the Gid (Glucose Induced degradation Deficient) complex. Upon glucose addition to cells, the regulatory subunit Gid4/Vid24 is synthesized, binds to the Gid-E3 complex and triggers FBPase ubiquitination and subsequent degradation. Gid1 and Gid8, two members of the Gid complex, were found to possess a CRA (CT11-RanBPM) domain of unknown function. Mutations inserted in this domain of Gid8 led to a notable impairment in FBPase degradation and polyubiquitination. However interactions between the mutated Gid8 and FBPase or interactions between the mutated Gid8 and the Gid complex still remained. Further work focused on the determination of the localization of most Gid proteins by indirect immunofluorescence. These experiments confirmed the cytosolic and nuclear localization of the proteins Gid1 and Gid8 described by Huh et al. Gid2 could not be localized by indirect immunofluorescence. However a nuclear localization sequence (NLS), a usual hint of the localization of proteins in the nucleus of eukaryotes, was discovered in the protein. This NLS sequence was fused to GFP and shown to actively transport the recombinant protein into the nucleus, confirming its efficiency as a nuclear localization sequence. A deletion of the NLS sequence was then carried out in Gid2, but the mutated protein was not stable in a non-fermentable carbon source; thus no further study on the influence of this NLS on FBPase degradation was performed. To determine the subcellular localization of FBPase, the enzyme was C-terminally marked with several tags. However FBPase localization was dependent on the tag used. FBPase-TAP was the only fusion protein degraded like the untagged FBPase. Using indirect immunofluorescence microscopy, the site of FBPase-TAP degradation was determined to be cytosolic. Finally, as an additional machinery required for the catabolite degradation process, we identifed the trimeric Cdc48-Ufd1-Npl4 complex. This AAA-ATPase complex acts between polyubiquitination of FBPase and its degradation by the proteasome. Furthermore, the amount of FBPase polyubiquitination, and the degradation of FBPase are strongly impaired in mutants of Ufd3, a substrate-processing cofactor of Cdc48. Interestingly Cdc48 interacts with the Gid8 subunit of the Gid complex. Finally Rad23 and Dsk2, two ubiquitin-binding proteins reported to escort polyubiquitinated substrates to the proteasome, were shown to be necessary for FBPase degradation. All these results suggest that polyubiquitinated FBPase may be recruited by the Cdc48-Ufd1-Npl4 machinery for its delivery to the 26S proteasome. Elimination of an additional gluconeogenic enzyme, phosphoenolpyruvate carboxykinase, was also shown to be dependent on the Cdc48-Ufd1-Npl4 complex.
In der Hefe Saccharomyces cerevisiae wird das regulatorische glukoneogenetische Schlüsselenzym Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) synthetisiert, wenn Zellen in Medien mit nicht fermentierbarer Kohlenstoffquelle wie Ethanol wachsen. Der Wechsel auf glukosehaltiges Medium führt zu einem schnellen Umschalten von der Glukoneogenese zur Glykolyse. FBPase wird dabei sehr schnell durch Phosphorylierung inaktiviert, polyubiquitiniert und durch das 26S Proteasom abgebaut. Die Polyubiquitinierung der FBPase wird von den ubiquitin-konjugierenden Enzymen Ubc1, Ubc4, Ubc5 und Ubc8 und der neuen Gid (Glucose Induced degradation Deficient) Ubiquitin Ligase durchgeführt. Nach Glukosegabe zu glukoneogenetischen Zellen wird die regulatorische Untereinheit Gid4 synthetisiert. Sie bindet an den Gid-E3 Komplex und steuert die Polyubiquitinierung und den Abbau der FBPase. Gid1 und Gid8, zwei Proteine des Gid Komplexes, enthalten eine CRA (CT11-RanBPM) Domäne mit unbekannter Funktion. Ziel dieser Arbeit war es die Bedeutung diese Domäne näher zu untersuchen. Mutationen der Domäne von Gid8 zeigten einen signfikanten Einfluss auf die Degradationsgeschwindigkeit und Polyubiquitinierung der FBPase, jedoch konnte kein Unterschied hinsichtlich der Interaktionen zum Gid Komplex bzw. zur FBPase festgestellt werden. Mittels Immunofuoreszenz wurde die Lokalisierung von Gid1 und Gid8 im Cytosol und im Kern bestimmt. Gid2 konnte nicht lokalisiert werden. Aber Gid2-Protein konnte mit einer "nuclear localization sequence" (NLS), ein guter Hinweis für die Kernlokalisation des Proteins, entdeckt werden. Die Wirksamkeit der NLS konnte wie folgt belegt werden. Nach Fusion dieser NLS Sequenz an GFP konnte gezeigt werden, dass ein aktiver Transport von NLS-GFP in den Kern erfolgt. Leider zeigte sich nach Deletion dieser Domäne in Gid2, dass das mutierte Protein auf nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen instabil war. Aus diesem Grund wurden keine weiteren Studien zum Einfluss der NLS Sequenz auf den FBPase Abbau durchgeführt. Zur Bestimmung der subzelluläre Lokalisierung von FBPase wurde das Enzym C-terminal mit verschiedenen Epitopen markiert. Es stellte sich jedoch heraus, dass die FBPase Degradation/Lokalisation von den unterschiedlichen Tag's beeinflusst wurde. Lediglich FBPase-TAP wurde gleich schnell wie die Wilt Typ Form abgebaut. Dieses Epitop-markierte Protein wurde mittels indirekter Immunofluoreszenz cytosolisch localisiert. Schliesslich wurde der Cdc48-Ufd1-Npl4 Komplex als zusätzlicher Faktor für FBPase Abbau identifiziert. Diese AAA-ATPase Komplex ist notwendig nach der Polyubiquitinierung der FBPase und vor ihrem Abbau durch das Proteasom. Zusätzlich wird die Menge der Polyubiquitinierung und der Abbau der FBPase in Mutanten des Cdc48 Kofaktors Ufd3 stark beeinflusst. Interessanterweise bindet Cdc48 an den Gid Komplex. Darüber hinaus konnte der Einfluss von Rad23 und Dsk2, zwei ubiquitinbindenden Proteinen, die verantwortlich für den Transport polyubiquitinierter Substrate zum Proteasom sind, auf den FBPase Abbau gezeigt werden. Alle Ergebnisse zusammengenommen weisen darauf hin, dass die polyubiquitinierte FBPase von der Cdc48-Ufd1-Npl4 Maschinerie rekrutiert und auf diesem Weg schliesslich ans Proteasom zur Degradation weitergegeben wird. Der Abbau der Phosphoenolpyruvat Carboxykinase, einem weitere glukoneogenetischen Schlüsselenzym, ist ebenfalls von Cdc48-Ufd1-Npl4 abhängig.
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