Festkörper-NMR Studien zur Struktur und Dynamik von Lipid-Peptid-Komplexen

Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Lipid-Peptid-Komplexe in der flüssigkristallinen Phase untersucht. Bei den betrachteten Peptiden handelte es sich um Gramicidin A, Melittin, die Peptaibole Trichogin-OMe und Alamethicin(L-Glu(OMe)7;18;19). Ziel der Untersuchungen war es, den Einfluss der Peptide auf die molekularen Eigenschaften in den verschiedenen Bereichen der Lipide zu erfassen, was letztlich Hinweise über den Einbau der Peptide in die Lipidmembran liefern sollte. Als experimentelle Verfahren wurden die Infrarotspektroskopie (FTIR) und Kernresonanzspektroskopie (NMR) eingesetzt.

Die Analyse der symmetrischen CH2-Streckschwingung ergab für alle Trichogin-OMe-Membranen bei Temperaturerhöhung eine deutliche Verschiebung der Bandenmaxima um 3 bis 4 cm-1 zu höheren Wellenzahlen, was eine Zunahme der Konformationsunordnung anzeigte. Aus den Streckschwingungsdaten wurde geschlossen, dass die Konformationsordnung der Kettenregion nach Zugabe von Trichogin-OMe nahezu unbeeinflusst blieb. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde angenommen, dass sich Trichogin-OMe parallel zur Membranoberfläche einlagert ("Carpet-like"-Modell), da in diesem Modell geringere Wechselwirkungen zwischen Trichogin-OMe und den Lipid-Molekülen bestehen. Der langsamere Bewegungsbereich der Lipid-Membranen wurde mit Hilfe der T1r -Experimente untersucht, wobei dieser Bereich hauptsächlich von den Ordnungsdirektorfluktuationen beherrscht wird. Die beobachteten Änderungen der T1r-Zeiten mit der Probenzusammensetzung konnten auf die unterschiedliche Membransteifigkeit zurückgeführt werden. Für die Probe mit dem höchsten Trichogin-OMe-Anteil wurde eine erhebliche Änderung der Kopfgruppenorientierung des Lipids festgestellt. Zusätzlich reflektierte eine zweite spektrale Komponente im 31P MAS/NMR-Spektrum die Dehydrierung der Kopfgruppe, die durch starke Wechselwirkungen zwischen Lipid und Trichogin-OMe verursacht wurde. Aufgrund dessen wurde angenommen, dass sich Trichogin-OMe (L/P = 5/1) nach dem "toroidal"-Modell einlagerte, da für dieses Modell der engste Kontakt zwischen dem Lipid-Molekül und dem Peptid erwartet wurde.

Durch den Einbau der Peptide Alamethicin, Gramicidin und Melittin wurde eine Verlangsamung der Ordnungsdirektorfluktuationen festgestellt, hervorgerufen durch die Einlagerung der Peptide und eine damit verbundene höhere Membranfestigkeit. Dieses Ergebnis unterschied sich von den Membranen mit dem Peptid Trichogin-OMe (für das L/P-Verhältnis größer 10/1), denn hier nahmen nach Zugabe von Peptid die Ordnungsdirektorfluktuationen zu und wurden erst bei größerem Peptid-Anteil langsamer. Für die Trichogin-OMe-Systeme wurde das "carpet-like" Modell angenommen. Für die Membranen, die Alamethicin, Gramicidin und Melittin enthalten, geht man von dem "toroidal" oder "barrel-stave" Modell aus, da durch diese Modelle die bessere Packung und die höhere Membranfestigkeit erklärt werden. Für die Proben mit Melittin und Gramicidin mit einem Lipid/Peptid-Verhältnis von 10/1 wurden erheblich kleinere quadrupolare Kopplungskonstanten (14N) und chemische Verschiebungsanisotropien (31P) bestimmt. Diese geringeren Werte deuten eine Änderung der Kopfgruppenorientierung an und können mit dem "toroidal"-Modell begründet werden, denn hier bewegen sich die DMPC-Moleküle im gekrümmten Membranteil schneller. Für das Gramicidin-System mit dem L/P-Verhältnis von 5/1 wurde im statischen 31P und 14N NMR-Spektrum mehr als eine Komponente beobachtet. Aufgrund dessen wurde von einer Änderung der Kopfgruppenorientierung ausgegangen. Die Peptide lagern sich nach dem "barrel-stave" Modell ein, denn in diesem Modell ist die Lipid-Bewegung insgesamt eingeschränkter als für das "toroidal" Modell, da hier kein gekrümmter Membranteil aus Lipid-Molekülen vorliegt.

Im Fall des Peptids Alamethicin standen verschiedene Proben zur Verfügung, die jeweils an unterschiedlichen Positionen mit der Spinsonde TOAC markiert waren. Der aus der Spinsonde resultierende paramagnetische Beitrag in den Spektren bzw. in den Relaxationszeiten der Lipid-Moleküle sollte dazu verwendet werden, die Orientierung der Peptidmoleküle in der Lipidmembran zu bestimmen. Die Spinsonden TOAC8 und TOAC16 im Peptid verursachten die größten paramagnetischen Beiträge am Ende der Alkylketten im Lipid-Molekül, sowohl in den 1H T1- als auch in den 13C T1- Messungen. Zusätzlich wurden für die Membran mit TOAC16 eine Verbreiterung des 1H Signals im Bereich der Kettenregion festgestellt. Für die Spinsonde TOAC1 wurde der größte Einfluss auf den Bereich der Kopfgruppe und des Glycerolrückgrats des Lipids festgestellt. Aus diesen Ergebnissen wurde auf eine integrale Einlagerung des Peptids Alamethicin in die DMPC-Membran geschlossen, da nur anhand dieses Modells die Einflüsse auf die unterschiedlichen Lipidbereiche zu erklären sind.

In recent years spectroscopic techniques, such as NMR and IR spectroscopy, have been extensively used in the field of biological membranes. In this connection it has been demonstrated that IR spectroscopy is suitable to monitor the conformational properties in the acyl chain region of the lipid molecules along with their changes as a function of temperature or sample composition. NMR spectroscopy determine the order characteristics in the phospholipid membranes, as well as to distinguish several dynamic processes over a wide time scale.

In the case of DMPC/trichogin-mixtures the FT-IR absorption spectroscopy was used to analyze the CH2 stretching bands, to examine the conformational state of the acyl chain region. The results show for all systems a shift of the band maxima to higher frequencies of about 3-4 cm-1 with increasing temperature which point to an increasing conformational disorder. On the basis of the available vibrational data it is concluded that the conformational order remains practically unaffected by the addition of trichoginOMe. These results imply that trichoginOMe is embedded in the lipid bilayer with the helix axis laying parallel to the bilayer plane resulting in minor interactions between trichoginOMe and the lipid molecules. In addition, the lipid dynamics was probed via T1r-experiments. It is concluded that these data are dominated by collective order fluctuations. The observed variations of T1r with sample composition can be attributed to differences of the membrane stiffness. For the sample with the highest trichoginOMe content, significant changes for the head group ordering are registered. In addition, a second spectral component, reflecting dehydration in the vicinity of the head group due to strong lipid-peptide interactions, can be separated in the 31P NMR spectra. It is reasonable to assume that this latter observation can be ascribed to the toroidal model for which a strong contact between the lipid molecules and the peptide is expected.

For the membranes mixed with alamethicin (L-Glu(OMe)7;18;19), gramicidin or melittin the collective order fluctuations are slowed down which is caused by the embedded peptides and the resulting higher membrane stiffness. These results differ from the membranes with the peptide trichoginOMe (L/P higher 10/1) because in these systems the order director fluctuations become faster after peptide addition and only slowed down for the highest peptide content. For the trichoginOMe system the "carpet-like" model was assumed. For the membranes with alamethicin, gramicidin and melittin the higher membrane stiffness can be explained with the "toroidal" or the "barrel-stave" model. In the case of the systems with melittin and gramicidin with a molar L/P ratio of 10/1 smaller quadrupole coupling constants and chemical shift anisotropies were derived. These smaller values point to a change in the head group orientation and can be explained with the "toroidal" model due to faster motions of the lipids in the curved bilayer part. For the gramicidin sample with a molar L/P-ratio of 5/1 more than one component occurs in the static 31P and 14N NMR spectra, pointing to a change in the head group orientation. The results are explained by the "barrel-stave" model because in this model the lipid-motion is more restricted than for the "toroidal" model, due to the missing curved bilayer part.

In the case of the peptide alamethicin the various peptide samples bear an spin label (TOAC) at either positions 1, 8 or 16. The relaxation rates of the different lipid positions, i.e. the head group and the acyl chain region, exhibit an additional contribution due to paramagnetic relaxation. This additional paramagnetic term in the relaxation data arises from the interaction between the examined nuclear spins and the electron spin in the label, and varies with the proximity of the nuclear spin and the TOAC label. Likewise, the linewidths are altered. The largest effect is registered for those regions which are in close vicinity to the label. The line width effects and the paramagnetic relaxation data can be thus exploited to locate the position of alamethicin within the DMPC bilayers. Our results show an integral arrangement of the peptide in the bilayer. This is motivated by the strong influence on the head group and the glycerol backbone of the lipid through the TOAC1 labeled peptide which has been seen in the broadened 1H NMR spectra and the highest paramagnetic relaxation rates. In addition, for the 31P nucleus a contribution from paramagnetic relaxation was only found for the TOAC1 label. Furthermore, the TOAC8 and 16 labeled peptides provide the highest paramagnetic effect at the end of the acyl chains, as shown by both the 1H T1 and 13C T1 measurements. In addition, the acyl chain in the 1H NMR spectra is broadened for the system with TOAC16. In summary, all experimental data point to an integral arrangement of alamethicin in the DMPC membrane.