Biosynthese von Carotinoiden mittels rekombinanten Mikroorganismen

Abstract

Diese Arbeit entstand aus einem gemeinsamen Projekt des Instituts für technische Biochemie (ITB) und des Instituts für Industrielle Genetik (IIG) an der Universität Stuttgart. Während das Institut für Industrielle Genetik für die molekularbiologischen Arbeiten zuständig war, oblagen dem Institut für Technische Biochemie, die Kultivierung und die Analytik. In dieser Arbeit sollte die Möglichkeit der Synthese von Carotinoiden in rekombinanten Pseudomonas putida KT2440 mit Zeaxanthin als Modellprodukt untersucht werden. Insbesondere sollten limitierende Schritte bei der Biosynthese identifiziert werden. Die Synthese der Carotinoide erfolgt dabei aus der zugefütterten Kohlenstoffquelle, meist Glucose. Aus dieser werden in mehreren Schritten die Vorstufen des Isoprens, das Isopentenylpyrophosphat (IPP) und das Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP) gebildet. Aus den beiden Vorstufen wird im bakteriellen Isoprenkatabolismus nun über die Zwischenstufen Geranylpyrophosphat und Farnesylpyrophosphat, Geranylgeranylpyrophosphat gebildet. Die zur Synthese der Carotinoide nötigen Enzyme werden durch Expression von einem Plasmid gebildet. Die Gene stammten aus dem natürlichen Carotinoidproduzenten Pantoea ananatis. Mit Hilfe dieser Enzyme wird dann das Tetraterpen Phytoen und aus diesem, nach einer mehrstufigen Einführung von Unsättigungen, das erste farbige Tetraterpen, das acylclische Lycopin gebildet. In weiteren Modifikationen können die Enden zum ß-Carotin zyklisiert und die Ringe schließlich zum Zeaxanthin hydroxyliert werden. Zur Hydroxylierung des ß-Carotins wurden die Cytochrom-P450-Monooxygenase CYP175A1 aus Thermus thermophilus und die beiden ß-Carotinhydroxylasen aus Pantoea ananatis (CrtZ) und Brevundimonas sp. SD212 (CrtZBrev) verglichen. CrtZBrev und CYP175A1 zeigten deutlich niedrigere Ausbeuten als CrtZ. Zur Analyse der gebildeten Produkte wurde eine Methode der HPLC etabliert und so angepasst, dass eine gute Trennung der Substanzen möglich war. Ferner wurde zur schnellen Untersuchung einer großen Zahl von Proben eine Methode der Dünnschichtchromatographie neu entwickelt. Als bei guter Ausbeute am einfachsten durchführbar erwies sich die Extraktion der Carotinoide mit Aceton. Es wurden Wiederfindungsraten > 97 % erhalten. Mehrere am IIG mit Hilfe der Transposonmutagenese erhaltene Mutanten zeigten eine höhere Transformationseffizienz als dem Wildtyp. Auch die produzierte Zeaxanthinmenge war größer. Die Mutante D7L3 (1,51 mg Zeaxanthin pro Gramm Biotrockenmasse) wurde für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. Beim Vergleich der beiden Vollmedien LB- und TB-Medium sowie dem Mineralmedium MEK zeigte sich, dass in TB-Medium mit Glycerin als zusätzlicher Kohlenstoffquelle mit 7,0 mg/g die mit Abstand höchste Zeaxanthinmenge hergestellt werden konnte. In LB-Medium lag die Ausbeute bei 1,3 mg/g und in MEK-Medium mit Glucose bei 2,5 mg/g. Die volumetrische Ausbeute war ebenfalls in TB-Medium mit 51,3 mg/l am höchsten. Bei LB- und MEK-Medium lag sie mit 2,2 mg/l beziehungsweise 1,7 mg/l deutlich niedriger. Während der Produktion stieg die Zeaxanthinmenge kontinuierlich an. Es wurden weiterhin ß-Carotin und ß-Cryptoxanthin in sehr geringen Mengen gefunden. Es konnten 0,1 mg/g ß-Carotin beziehungsweise 0,6 mg/g ß-Cryptoxanthin in TB-Medium gemessen werden. In LB- und MEK-Medium waren die Mengen noch niedriger. Andere Carotinoidvorstufen konnten nicht nachgewiesen werden. Aus den erhaltenen Daten kann abgeleitet werden, dass die Hydroxylierung den Engpass bei der Zeaxanthinsynthese darstellt, da hier die Zwischenstufen gefunden werden konnten, während die anderen Reaktionen ohne Akkumulierung von Zwischenstufen abliefen. Es konnte durch CD-Spektroskopie und chirale Dünnschichtchromatographie gezeigt werden, dass es sich bei dem in P. putida gebildeten Zeaxanthin um das (3R,3’R)-Isomer handelt. Das Expressionssystem wurde auch in E. coli verwendet. Die Ausbeute im besten Fall war hier aber deutlich niedriger und lag bei 2,4 mg/g. Zur weiteren Erhöhung der Ausbeute in P. putida D7L3 wurden verschiedene Additive zum Medium geprüft. Am vielversprechendsten erwies sich Lecithin. Ein Zusatz von 10 % Lecithin vermochte innerhalb von 24 Stunden die Zeaxanthinmenge um das 10,4fache auf 216 mg/g zu steigern. Die Hochskalierung vom Schüttelkolben in den 5 l-Fermenter war erfolgreich, die Ausbeute blieb jedoch hinter der im Schüttelkolben deutlich zurück. Außerdem wurde die Bildung von Alginat beobachtet. Dies führte dazu, dass die Kultivierung nach spätestens zwei Tagen abgebrochen werden musste. In TB-Medium wurden Zeaxanthinausbeuten von 20 mg/l, in Mineralmedium wurde eine Ausbeute von 1,2 mg/l erreicht. Wurden Teilernten durchgeführt, bei welchem die Hälfte des Mediums einmal täglich gegen frisches Medium getauscht wurde, konnte die Ausbeute auf 5,1 mg/l gesteigert und die Kultivierung über drei Tage geführt werden. Bei Teilernten war das Produkt auch mit Lycopin verunreinigt.

This work is the result of a collaboration between the Institutes of Technical Biochemistry (ITB) and Industrial Genetics (IIG) within the Centre of Systems Biology at the University of Stuttgart. The Institute of Industrial Genetics was responsible for the molecular biology work and the Institute of Technical Biochemistry investigated the cultivation conditions and the analytical methods for carotenoids. In this work, Pseudomonas putida KT2440 was established as a production host for carotenoids using zeaxanthin as a model system. Limiting steps in biosynthesis should be identified. Biosynthesis of carotenoids starts with the carbon source, usually glucose. It was metabolised in multiple steps to the building blocks of the isoprenoids, isopentenyl pyrophosphate (IPP) and dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP). Bacteria form geranylgeranyl pyrophosphate via the intermediates geranyl pyrophosphate and farnesyl pyrophosphate. The genes encoding these enzymes were cloned at IIG from the naturally carotenoid producing bacterium Pantoea ananatis. These enzymes produce the tetraterpene phytoen, which forms in four steps the first coloured tetraterpene, lycopene. This molecule is then cyclised and hydroxylated to form ß-carotene and zeaxanthin, respectively. For the hydroxylation of ß-carotene three enzymes were compared, the cytochrome P450 monooxygenase CYP175A1 from Thermus thermophilus, the ß-carotene hydroxylases from Pantoea ananatis (CrtZ) and Brevundimonas sp. SD212 (CrtZBrev). The use of CrtZBrev and CYP175A1 led to lower yields than CrtZ. For analysis of the formed carotenoids a method using high performance liquid chromatography was established and modified for optimal separation of the produced substances. For fast and simultaneous analysis of a high number of samples a method using thin layer chromatography was developed. The extraction of carotenoids with acetone combines a high yield and an easy procedure. The recovery was higher than 97 %. The transformation efficiencies and yields of zeaxanthin reached with mutants using transposon mutagenesis was higher than in the wild type but differed from mutant to mutant. Mutant D7L3 (1.20 mg zeaxanthin per g CDW) was selected for further investigation. A comparison of the two full media, LB and TB, and the mineral medium, MEK, showed that the amount of zeaxanthin in TB medium supplemented with glycerol was higher with 7.0 mg/g than the other media. The yield in LB medium was 1.3 mg/g and in MEK with glucose as carbon source was 2.5 mg/g. The volumetric yield in TB medium was with 51.3 mg/l the highest. In LB and MEK medium, the volumetric yield was 2.2 mg/l and 1.7 mg/l, respectively. The amount of zeaxanthin increased continuously during the cultivation, while ß-carotene and ß-cryptoxanthin stayed at a low level. The maximum yield of ß-carotene and ß-cryptoxanthin in TB medium was 0.1 mg/g ß-carotene and 0.6 mg/g, respectively. In LB and MEK medium the amount was even lower. No other precursors were found in the samples. From this data, it was assumed that the hydroxylation is the bottleneck of zeaxanthin synthesis. For the other reactions, e.g. the desaturation and cyclisation, no intermediates were accumulated. The synthesized zeaxanthin was investigated with chiral thin layer chromatography and CD spectroscopy to solve its stereochemistry. It was found the CrtZ was selective for (3R,3’R)-zeaxanthin in P. putida. The expression system was also used in E. coli for comparison. In the best case 2.4 mg/g zeaxanthin was found with CrtZ in TB medium. To enhance the yield in P. putida D7L3 different additives were tested. Lecithin showed the best effect. The addition of 10 % lecithin increases the produced amount by a factor of 10.4 within 24 h to 216 mg/g. The upscaling from a shaking flask to a 5 l fermenter scale was successful, but the yield was lower than the one reached in flasks and the formation of alginate was observed. This led to a decreased oxygen input in the medium. For this reason the process was stopped after two days. In TB medium the amount of zeaxanthin was up to 20 mg/l and in mineral medium 1.2 mg/l of zeaxanthin was reached. With a harvest of half of the fermenter volume and refill with fresh media every day 5.1 mg/l of zeaxanthin were obtained and the process time could be extended to three days. Unfortunately, in this case a contamination of zeaxanthin with lycopene could be observed.