Entwicklung und Charakterisierung einer partikulären biobasierten Wirkstoffformulierung zur kontrollierten Freisetzung an der Regio olfactoria

Abstract

Diese Dissertation beschäftigt sich mit der Entwicklung und Charakterisierung biobasierter partikulärer Wirkstoffformulierungen für die Verabreichung von Wirkstoffen in der Riechrinne, lat. Regio olfactoria. Die Regio olfactoria ist über den Riechnerv und den Trigeminusnerv direkt mit dem Gehirn und dem zentralen Nervensystem verbunden. Die intranasale Wirkstoffapplikation ist eine innovative Route insbesondere für Makromoleküle und Proteine, die durch Transport entlang dieser Nerven die Umgehung der Blut-Hirn-Schranke ermöglicht. Dieser sogenannte Nose-to-Brain Transport ist deshalb aktuell vor allem für die Therapie neurologischer Erkrankungen, wie Multiple Sklerose, beispielsweise mit therapeutischen monoklonalen Antikörpern von Interesse. Um derartige partikuläre Wirkstoffformulierungen zu erforschen, wurden zunächst Polylactid-co-Glycolid-Nanopartikel (PLGA) in Chitosan als Matrixmaterial mittels Sprühtrocknung zu PLGA-Chitosan-Nano-in-Mikro-Partikeln (NiMP) verkapselt. Solche sprühgetrockneten NiMPs wurden noch nie zuvor in der Literatur beschrieben, da bisher ausschließlich emulsionsbasierte Verfahren zur Beschichtung von PLGA-Nanopartikeln mit Chitosan genutzt wurden. Die in dieser Dissertation hergestellten NiMPs wiesen eine sphärische Form und Partikelgrößen von 5,75-6,61 µm auf. In ex vivo olfaktorischer Mukosa vom Schwein zeigten unverkapselte mit Emulsionspolymerisation hergestellte PLGA-Nanopartikel (80 nm, 175 nm, 520 nm) eine größen- und zeitabhängige Aufnahme. Es wurde ermittelt, dass 520 nm große PLGA-Partikel innerhalb von 15 min mit Zellkernen und Neurofilamenten assoziierten. Im Vergleich dazu steigerte Chitosan die Aufnahme der sprühgetrockneten NiMPs, was auf die Eigenschaft von Chitosan zurückgeführt wurde, Tight Junctions im olfaktorischen Epithel öffnen zu können und so einen parazellulären Transport zu ermöglichen. Die Öffnung von Tight Junctions durch die Wechselwirkung mit Chitosan wurde zum ersten Mal in olfaktorischem Gewebe mittels immunhistologischer Färbung des Proteins Zonula Occludens 1 (ZO-1) gezeigt. Anschließend wurde der Einfluss unterschiedlicher Chitosanderivate mit Deacetylierungsgraden (DD) von 80-90 % und Molekulargewichten (MW) von 20-500 kDa auf die Partikelmorphologie, die Partikelgrößenverteilung und die Partikelausbeute des Sprühtrocknungsprozesses untersucht. Das MW der Chitosan-Partikel, weniger hingegen deren DD beeinflusste die Morphologie und die Größenverteilung der aus der Sprühtrocknung resultierenden Partikel sowie die Ausbeute des Sprühtrocknungsprozesses. Bei 100 °C Einlasstemperatur konnten Partikel mit glatter Oberfläche, monomodaler Partikelgrößenverteilung (Polydispersitätsindex 0,02±0,01) und 69±9 nm Durchmesser produziert werden. Die in dieser Dissertation optimierten Prozessparameter ermöglichten zudem hohe Partikelausbeuten von über 60 % und eine kontinuierliche Produktion über einen Zeitraum von bis zu 40 min. Darüber hinaus wurden die Wirkstoffe Biotin und Ocrelizumab in dieser Dissertation zum ersten Mal in Chitosan verkapselt; dabei konnte eine hohe Verkapselungseffizienz von über 80 % für Beladungen zwischen 5 gew.% (Biotin, Ocrelizumab) und 15 gew.% (Ocrelizumab) mittels Sprühtrocknung erzielt werden. Mittels spektroskopischer Methoden wurde kein Unterschied zum nativen Molekül festgestellt, was eine intakte primäre und sekundäre Proteinstruktur impliziert. Lediglich ein bis zu 18%iger Verlust der Bindungskapazität nach erneuter Freisetzung aus den sprühgetrockneten Chitosan-Partikeln lies den Rückschluss auf Defekte der Tertiär- oder Quartärstruktur des Proteins zu. Die Glasübergangstemperatur der entwickelten Partikel betrug Tg ≈ 36 °C und bestätigte deren Lagerstabilität über fünf Wochen bei Raumtemperatur. Die Dissolutionstests in vitro zeigten keinen Burst-Release. Der Diffusionskoeffizient von Biotin wurde durch die Verkapselung in die Chitosan-Partikelmatrix auf DBiotin-Partikel = 4,11 10-5 cm²/s reduziert. Für Ocrelizumab resultierte ein signifikant niedrigerer Diffusionskoeffizient mit DOcrelizumab-Partikel = 1,79 10-6 cm²/s aus den Partikeln. Nach 360 h wurden 84,43±4,85 % Ocrelizumab freigesetzt. Die erhobenen Daten ließen die Anwendung des Korsmeyer-Peppas Modells zu, welches eine vollständige Freisetzung des Wirkstoffs innerhalb von 395 h voraussagte und eine Wirkstofffreisetzung über anormalen Transport anzeigte. Um die entwickelte Partikelformulierung an der Regio olfactoria fixieren zu können wurden native und Tyramin-modifizierte Hyaluronsäure-Lösungen (HA, HA-Tyr) als mögliche Beschichtung auf Mukosa untersucht. Dazu wurde das Spreitungsverhalten der HA-Lösungen unter Laborbedingungen und in einer Klimakammer - die physiologischen Bedingungen der Nase nachbildend – analysiert. Hierzu wurde ein Muzin-Agarose-basiertes artifizielles Mukosa-Analog mit der ex vivo Mukosa verglichen und validiert. Mit sinkender Polymerkonzentration der HA-Lösung reduzierte sich der Kontaktwinkel, das Seitenverhältnis des Tropfens stieg an und die Spreitung auf der Mukosa wurde beschleunigt. Die physiologischen Bedingungen der Nase begünstigten ebenfalls die Spreitung. Insgesamt konnte in dieser Dissertation erfolgreich eine Chitosan-basierte partikuläre Wirkstoffformulierung mittels Sprühtrocknung entwickelt werden, welche die strukturell intakte Verkapselung niedrigmolekularer Wirkstoffe und monoklonaler Antikörper ermöglicht. Für den therapeutischen Antikörper Ocrelizumab konnte eine kontrollierte Freisetzung über 15 Tage erzielt werden und das Matrixmaterial Chitosan bewirkte die Öffnung von Tight Junctions in der olfaktorischen Mukosa vom Schwein. Dadurch konnte eine verstärkte Aufnahme im olfaktorischen Epithel erzielt werden, was der Überwindung dieser biologischen Barriere entspricht und die Eignung der entwickelten Partikel für die intranasale Applikation deutlich macht. Das Spreitungsverhalten UV-vernetzbarer HA-Tyr-Lösungen ist für die Applikation auf Mukosa, und damit als befestigende Komponente des in dieser Dissertation entwickelten Drug Delivery Systems in der Nase geeignet.