Subzelluläre Lokalisierung des hochkonservierten Gerüstproteins hMon2 in Säugerzellen und Identifizierung neuer Interaktionspartner

Abstract

Intrazellulärer Proteintransport findet über Transportvesikel entlang der endozytotischen und sekretorischen Wege der Zelle statt. Regulation und Mechanismus dieser hochdynamischen Prozesse wird von zahlreichen spezifischen Proteinen an den verschiedenen Stufen des Vesikeltransports überwacht. Während meiner Doktorarbeit habe ich das humane hMon2 Protein, welches vermutlich eine besondere Funktion an der Vesikelbildung und -transport hat, untersucht. Das hMon2 Protein (190 kDa) ist das humane Ortholog von Ysl2p (187 kDa) der Hefe Saccharomyces cerevisiae, welches bereits mehrfach untersucht wurde. Ysl2p assoziiert peripher mit endosomalen Membranen, wird für den endozytotischen Membrantransport und die Aufrechterhaltung der Struktur der Vakuole benötigt. Ysl2p ist ein Mitglied des endosomalen Membranremodulierungskomplexes Ysl2p-Neo1p-Arl1p-Dop1p. Die Multidomänenproteine der Mon2/Ysl2 Familie sind in bestimmten Sequenzbereichen mit den großen Arf-GEF Untergruppen BIG/Sec7 und GBF/Gea/GNOM verwandt. Ich habe mittels mikroskopischer Untersuchungen gefunden, dass siRNA vermittelte Depletion von hMon2 in HeLa Zellen Veränderungen in der subzellulären Verteilung der Adapterproteine AP-1, AP-3, GGA1, GGA3 und EpsinR verursacht. Während die Adapterproteine in Kontrollzellen hauptsächlich in der Zellmitte oder als feine Strukturen im Zytoplasma verteilt sind, wurden diese in hMon2 depletierten Zellen diffus umverteilt oder als vergrößerte Strukturen in der Zellperipherie vorgefunden. Dabei ist die Morphologie des trans- und cis Golgi-Apparats nicht betroffen, da die subzelluläre Verteilung von dem trans Golgi-Netzwerk (TGN) und endosomalen Markerprotein TGN46, dem cis-Golgi Protein GM130 und Arf1 nicht verändert wird. Weiter, weisen die Zellen morphologische Veränderungen des endosomalen rezyklierenden Kompartiments auf, was durch Aufnahmeexperimente mit Alexa Fluor-Transferrin (AF-Tfn) gezeigt wurde. Diese tubulären Kompartimente sind mit AP-1 und GGA3 positiven pleomorphen Strukturen dekoriert. hMon2 wurde mit dem Golgin p230 (TGN Markerprotein), mRFP-ARF1 und teilweise mit den endosomalen und trans-Golgi assoziierten Clathrinadapterproteinen GGA1, GGA3, AP-1 und EpsinR lokalisiert. Zudem konnte im Immunpräzipitationsversuch eine Bindung von hMon2 mit GGA1, sowie mit GGA3 gezeigt werden. Kolokalisierung wurde auch mit internalisiertem AF-Tfn und dem TfnR beobachtet. Dagegen wurde eGFP-hMon2 nicht mit den cis-Golgi Markerprotein GM130 und der Untereinheit des COPI Hüllproteins β-COP kolokalisiert. Darüber hinaus, konnte ich durch Bindungsexperimente erste Hinweise auf eine mögliche Interaktion von hMon2 mit Aktin, dem aktinabhängigen nichtmuskulären Motorprotein Myosin II und dem mikrotubuliabhängigen ubiquitären Motorprotein Kinesin-1 (KIF5B) sammeln. Am Mikroskop war auch eine gute Überlappung von eGFP-hMon2 und Kinesin 1 an Organellen in der Zellmitte zu sehen. Die Ergebnisse wurden durch Zeitraffermikroskopie-untersuchungen, wo sich eGFP-hMon2 positive vesikelartige Strukturen von der Zellmitte in Richtung Zellperipherie möglicherweise entlang der Bahnen des Zytoskeletts bewegen, unterstützt. Auch konnte ich zeigen, dass HA-hMon2 und möglicherweise auch Ysl2p mit dem prozessiven Hefe Motorprotein Venus-Myo2p interagieren könnten. Weitere Experimente mit verkürzten Versionen von hMon2 haben gezeigt, dass der C Terminus essentiell für hMon2 Dimerisierung und Funktion ist. Bisher deuten meine Ergebnisse darauf hin, dass das Multidomänenprotein hMon2 in dem Bereich der Zelle vorkommt, wo vesikulärer Membranverkehr am TGN und tubulär endosomalen Netzwerk (TEN) stattfindet, und dass es möglicherweise ein molekulares Verbindungsglied von Membrantransportprozessen und Zytoskelett darstellen könnte. Vermutlich ist es an der Regulation der Rekrutierung von Adapterproteinen während der Vesikelbiogenese, aber auch bei Abschnürung der Vesikel und deren Transport beteiligt. Ebenso unterstützen die Ergebnisse die Verwandtschaft von hMon2 mit den 200 kDa Arf GEF Proteinen.

Intracellular protein transport occurs via vesicular transport along the secretory and endocytic pathways. The regulation and mechanism of these highly dynamic processes is controlled by numerous specific proteins at various steps of this vesicular transport. During my doctoral work I examined the human hMon2 protein, which most probably has a specific function in the vesicle biogenesis and transport. hMon2 protein (190 kDa) is the human orthologue of the yeast Saccharomyces cerevisiae Ysl2p (187 kDa), which has been multiply studied. Ysl2p associates peripherally with Golgi and endosomal membranes, it is required for endocytic membrane transport and the maintenance of the vacuole structure. Ysl2p is a component of the endosomal Ysl2p-Neo1p-Arl1p-Dop1p membrane remodelling complex. The multidomain proteins of the Mon2/Ysl2 family is closely related in specific sequence regions to the large Arf-GEF family subgroups BIG/Sec7 and GBF/Gea/GNOM. By microscopy analysis I have found that siRNA mediated depletion of hMon2 in HeLa cells causes changes in the subcellular distribution of adaptor proteins AP-1, AP-3, GGA1, GGA3 and EpsinR. While in control cells the adapter proteins were distributed mainly in the cell center and in small foci in the cytoplasm, in hMon2 depleted cells they were found on enlarged structures or diffusely redistributed to the cell periphery. The morphology of the trans- and cis-Golgi apparatus was not affected, because the subcellular distribution of the trans-Golgi network (TGN) and endosomal marker protein TGN46, the cis-Golgi protein GM130 and Arf1 was not altered. Further, cells display morphological changes of the endosomal recycling compartment showed by Alexa Fluor-transferrin (AF-Tfn) uptake assays. This tubular compartment is decorated with AP 1 and GGA3 positive pleomorphic structures. hMon2 was localized with the golgin p230 (TGN marker protein), mRFP-ARF1 and partially with the endosomal and trans-Golgi associated clathrin adaptor proteins GGA1, GGA3, AP-1 and EpsinR. Additionally, binding of hMon2 with GGA1, as well as with GGA3 could be shown by immunoprecipitation experiments. Colocalization was also found with internalized AF-Tfn and TfnR. In contrast, eGFP hMon2 was not colocalized with the cis Golgi marker protein GM130 and COPI coat protein subunit β-COP. Furthermore, by binding experiments I could show that hMon2 interacts with actin and the actin dependent non-muscle motor protein Myosin II and the microtubule dependent ubiquitous kinesin-1 motor protein, KIF5B. Under the microscope there was also great overlap of eGFP-hMon2 and kinesin-1 on organelles in the cell center detectable. Time-lapse microscopy studies support these findings where eGFP-hMon2 positive vesicle-like structures move from the cell center to the cell periphery probably along cytoskeletal tracks. I could also show that HA-hMon2 and potentially yeast Ysl2p interact with the yeast processive motor protein Venus-Myo2p. Further experiments with truncations of hMon2 revealed that the C-terminus is essential for hMon2 dimerization and function. Until now, my findings point the multidomain protein hMon2 to be present in the region where vesicular membrane traffic at trans Golgi network (TGN) and tubular endosomal network (TEN) takes place, and maybe to act as a molecular link between membrane transport processes and the cytoskeleton. It probably participates in the regulation of adapter protein recruitment during the vesicle biogenesis and also in the vesicle fission and transport. My results also support the relationship of hMon2 to the 200 kDa Arf GEF Sec7 family. However, further investigations are required to ascertain the function of hMon2.