The unfolded protein response in fission yeast : Ire1 modulates stability of select mRNAs to maintain protein homeostasis

Abstract

Virtually all proteins that eukaryotic cells display on their surface or that are secreted into the extracellular spare are first folded and assembled in the membrane-surrounded organelle endoplasmic reticulum (ER). Only properly folded and assembled proteins depart from the ER to the cell surface. If the ER does not have enough capacity to fold, a condition termed “ER stress”, a signal pathway called the “Unfolded Protein Response” (UPR), is switched on to increase the protein folding capacity, to expand the surface area and volume of the compartment. All eukaryotic cells, from unicellular yeasts to mammalian cells, contain a highly conserved protein-folding sensor Ire1. In all species analyzed to date, Ire1, an ER membrane-resident kinase/endoribonuclease, is known to activate the UPR through an unconventional messenger RNA (mRNA) splicing mechanism to induce translation of a potent transcription factor Hac1 (in yeast) or XBP1 (in metazoans). This unique splicing event provides the switch that drives a comprehensive gene expression program in which the production of ER components is increased to boost the protein folding capacity of the compartment. In this thesis an organism is identified, the yeast Schizosaccharomyces pombe, in which the UPR does not involve mRNA splicing or the initiation of a gene expression program to increase the folding capacity of the ER. Rather Schizosaccharomyces pombe lacking, a Hac1/XBP1 ortholog, utilizes Ire1 RNase activity to an entirely different end. We found that activation of Ire1 in S. pombe leads to the decay of a specific class of mRNAs that all encode proteins entering the ER. Interestingly, the set of down-regulated mRNA targets are particularly enriched for those encoding proteins involved in sterol metabolism, suggesting a potential qualitative change of the physiology of the cell. The deletion of the cytosolic mRNA degradation pathway shows an accumulation of RNA cleavage fragments of the down-regulated mRNA targets upon ER stress, an event by means that the Ire1 endonuclease directly cleaves these mRNAs. Intriguingly, the down-regulated mRNAs contain a short three-nucleotide base UG/C consensus at the Ire1 cut sites where cleavage occurs after G. Thus, rather than increasing the protein folding capacity of the ER when faced with an increased protein folding load, S. pombe cells correct the imbalance by decreasing the load via mRNA cleavage. Besides decreasing the ER load, a single mRNA—the mRNA that encodes the molecular chaperone BiP, which is one of the major protein-folding components in the ER—uniquely escapes this decay. Rather then being degraded, Ire1 truncates Bip1 mRNA in its 3’ UTR, which—counter-intuitively stabilizes the non-polyadenylated 5’ fragment and results in increased Bip1 translation. Decreasing the protein load by selective mRNA degradation and the single up-regulation of the major chaperone in the ER illustrate how a universally conserved machinery has been invented to maintain ER homeostasis in fission yeast.

Der Großteil aller sekretorischen Proteine in eukaryotischen Zellen, entweder Plasmamembran Proteine oder Proteine die in den extrazellulären Raum sekretiert werden, durchlaufen das membranumschlossene Endoplasmatische Retikulum (ER), wo sie gefaltet und zu Komplexen zusammengesetzt werden. Nur korrekt gefaltete und zusammengesetzte Proteine im ER werden bis zur Zelloberfläche weitergeleitet. Falls das ER nicht über ausreichende Kapazitäten zur Proteinfaltung verfügt, ein Zustand den man auch „ER Stress” bezeichnet, wird daraufhin ein Signalweg angeschaltet, der sogenannte “Unfolded Protein Response” (UPR), der eine Erhöhung der Proteinfaltungkapazität im ER zur Folge hat und das Volumen des Kompartiments erweitert. Alle eukaryotischen Zellen, von Einzellern wie Hefe bis zu menschlichen Zellen, besitzen einen hochkonservierten Proteinfaltungs-Sensor Ire1, eine ER-Transmembran-Protein-Kinase/Endoribonuklease. In allen bisher analysierten Spezies initiiert Ire1 den “Unfolded Protein Response” mittels einer unkonventionellen mRNA Spleißreaktion, was zur Translation und Aktivierung eines potenten Transkriptionsfaktor Hac1 (in Hefe) oder XBP1 (in Metazoen) führt. Diese einzigartige Spleißreaktion fungiert als eine Art Schalter, welcher bei Aktivierung ein umfangreiches Expressionsprogramm auslöst, um die Proteinfaltungsmaschinerie zu erweitern und das Voulmen des Kompartment zu vergrößern. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass der UPR einen Mechanismus auslösen kann, der weder eine mRNA Spleißreaktion, noch ein Transkriptionsprogramm für die Erhöhung der Kapazität der Proteinfaltung im ER induziert. Vielmehr benutzt die Hefe Schizosaccharomyces pombe, die keinerlei Hac1/XBP1 Orthologe besitzt, Ire1 auf eine komplett andere Art und Weise. Die Aktivierung von Ire1 in S. pombe führt zu einem Abbau von selektionierten mRNAs, die alle für sekretorische Proteine kodieren. Dabei ist festzustellen, dass eine signifikante Anzahl der abgebauten mRNAs, für Proteine kodieren, die im Sterol-Metabolismus involviert sind, was auf eine mögliche qualitative Veränderung der Zellphysiologie hinweisen könnte. Durch das Ausschalten des zytosolischen Abbauweges für mRNAs konnten endonukleolytische mRNA Zwischensprodukte stabilisiert werden, was darauf hinweist, dass Ire1 diese mRNAs direkt schneidet. Interessanterweise teilen diese abgebauten mRNAs eine Konsensus-Sequenz in ihrer von Ire1 geschnittenen Sequenz, die aus den drei Basenpaaren UG/C bestehend, wobei Ire1 nach dem Nukleotid G schneidet. Im Gegensatz zu einer Vergrößerung der Faltungsmaschinerie bei erhöhter Konzentration an fehlgefalteten Protein im ER, korrigiert S. pombe also das Ungleichgewicht letztendlich durch Verringerung des Proteinimportes bei gleichbleibender Kapazität der Proteinfaltung. Neben der Drosselung des Proteinimports in das ER, entgeht eine einzelne mRNA, die von BiP, eines der wichtigsten Faltungshelfer im ER, diesem Abbaumechanismus. Statt einer Degradation wird die Bip1 mRNA innerhalb der 3’ UTR durch Ire1 geschnitten und verkürzt, was entgegen den Erwartungen, das nicht-polyadenylierte 5’ Fragment stabilisiert und die Translation von Bip1 erhöht. Die Reduktion des Proteinimports in das ER durch den selektiven Abbau von mRNAs und die Erhöhung eines einzelnen Chaperons im ER veranschaulicht, wie eine omnipräsente konservierte Maschinerie für die Erhaltung des ER Gleichgewichts variiert wurde.