Regulation of the catalytic activity and specificity of DNA nucleotide methyltransferase 1

Abstract

DNA nucleotide methyltransferase 1 (Dnmt1) is mainly responsible for the maintenance of DNA methylation in mammals and plays a crucial role in the epigenetic control of gene expression. Dnmt1 recognizes and methylates hemimethylated CpG sites formed during DNA replication. In the present work, the mechanistic details of the substrate recognition by the catalytic domain of Dnmt1, the possible role of the CXXC and RFTS domains of Dnmt1 in the regulation of specificity and activity of Dnmt1, and the influence of the Ubiquitin-like PHD and RING finger domain-containing 1 (Uhrf1) protein on the enzymatic properties of Dnmt1 was investigated. Using modified substrates, the functional roles of individual contacts of the Dnmt1 catalytic domain with the CpG site of the DNA substrate were analysed. The data show that the interaction with the 5-methylcytosine:guanine pair is required for the catalytic activity of Dnmt1, whereas the contacts to the non-target strand guanine are not important, since its replacement with adenine increased the activity of Dnmt1. It was proposed that the CXXC domain binding to unmethylated CpG sites increases the specificity of Dnmt1 for hemimethylated DNA. Our data showed that the CXXC domain does not influence the enzyme’s specificity in the full-length Dnmt1. In contrast, mutagenesis in the catalytic domain introducing an M1235S exchange resulted in a significant reduction in specificity. Therefore, the readout for the hemimethylated DNA occurs within its catalytic domain. It was observed in a crystal structure that the RFTS domain of Dnmt1 inhibits the activity of the enzyme by binding to the catalytic domain and blocking the entry of the DNA. By amino acid substitution in the RFTS domain its positioning within the catalytic domain was destabilized and a corresponding increase in the catalytic rate was observed, which supports this concept and suggests a possible mechanism to allosterically regulate the activity of Dnmt1 in cells. Uhrf1 has been shown to target Dnmt1 to replicated DNA, which is essential for DNA methylation. Here it is demonstrated that Uhrf1 as well as its isolated SRA domain increase the activity and specificity of Dnmt1 in an allosteric mechanism. The stimulatory effect was independent of the SRA domain’s ability to bind hemimethylated DNA. The RFTS domain of Dnmt1 is required for the stimulation, since its deletion or blocking of its interaction with the SRA domain, significantly reduced the ability of Uhrf1 to increase the activity and specificity of Dnmt1. Uhrf1, therefore, plays multiple roles that support DNA methylation including targeting of Dnmt1, its stimulation and an increase of its specificity.

Die DNA-Methyltransferase 1 (Dnmt1) ist hauptverantwortlich für die Konservierung der DNA-Methylierung bei Säugetieren und spielt eine entscheidende Rolle in der epigenetischen Kontrolle der Genexpression. Dnmt1 erkennt und methyliert hemimethylierte CpG-Stellen, die während der DNA-Replikation gebildet werden. In der vorliegenden Arbeit wurden mechanistische Details der Substraterkennung durch die katalytische Domäne von Dnmt1, die mögliche Rolle der CXXC- und RFTS-Domänen in der Regulation der Spezifität und Aktivität von Dnmt1 sowie der Einfluss des Ubiquitin-like PHD- und RING-Finger-Domänen enthaltenden 1 (Uhrf1) Proteins auf die enzymatischen Eigenschaften von Dnmt1 untersucht. Mit verschiedenen modifizierten Substraten wurde die funktionelle Rolle einzelner Kontakte der katalytischen Domäne von Dnmt1 mit der CpG-Stelle der Substrat-DNA untersucht. Unsere Daten zeigen, dass die Interaktion mit dem 5-Methylcytosin:Guanin-Paar für die katalytische Aktivität von Dnmt1 notwendig ist, während die Kontakte zum im Gegenstrang liegenden Guanin offenbar nicht von Bedeutung sind, da der Austausch dieses Guanins gegen Adenin zu einer erhöhten Aktivität von Dnmt1 führte. In der Literatur wurde vorgeschlagen, dass die CXXC-Domäne durch die Bindung an unmethylierte DNA die Spezifität von Dnmt1 für hemimethylierte DNA erhöhen kann. Wir konnten allerdings zeigen, dass die CXXC-Domäne von Dnmt1 die Spezifität des Enzyms nicht beeinflusst. Im Gegensatz dazu führte der Austausch M1235S in der katalytischen Domäne von Dnmt1 zu einer signifikanten Reduktion der Spezifität. Daher muss die Erkennung hemimethylierter DNA innerhalb der katalytischen Domäne von Dnmt1 stattfinden. Die Untersuchung einer Kristallstruktur ergab, dass die RFTS-Domäne die Aktivität von Dnmt1 durch Bindung an die katalytische Domäne und die Blockierung der Eintrittsstelle der DNA hemmt. Durch Aminosäuresubstitutionen in der RFTS-Domäne konnte deren Positionierung innerhalb der katalytischen Domäne destabilisiert werden, was zu einer entsprechenden Erhöhung der katalytischen Rate führte. Unsere Beobachtung unterstützt dieses Konzept und zeigt einen möglichen Mechanismus auf, mit dem die Aktivität von Dnmt1 in Zellen allosterisch reguliert werden kann. Uhrf1 rekrutiert Dnmt1 an kürzlich replizierte DNA. Außerdem konnten wir zeigen, dass Uhrf1 sowie seine isolierte SRA-Domäne die Aktivität und Spezifität von Dnmt1 nach einem allosterischen Mechanismus erhöht. Diese stimulierende Wirkung war unabhängig von der Fähigkeit der SRA-Domäne, hemimethylierte DNA zu binden. Die RFTS-Domäne war für die Stimulation erforderlich, da ihre Entfernung oder die Blockade der Wechselwirkung mit der SRA-Domäne die Fähigkeit von Uhrf1, die Aktivität und Spezifität von Dnmt1 zu steigern, deutlich reduziert. Unsere Daten zeigen, dass Uhrf1 bei der Unterstützung der DNA-Methylierung mehrere Aufgaben erfüllt, welche die Rekrutierung, Stimulation und Steigerung der Spezifität von Dnmt1 umfassen.