Studies on variable surface loop regions of the ene reductase NCR from Zymomonas mobilis

Abstract

The present work deals with the flavin-dependent ene reductases from the Old Yellow Enzyme family which catalyze a trans-hydrogenation of activated C=C double bonds with absolute stereospecificity due to the architecture of their active site. All family members possess as a structural backbone a barrel made of eight parallel beta-sheets, which are connected by loops with eight surrounding alpha-helices. Despite great structural and sequential similarities, the individual family members demonstrate significant differences in substrate specificity, thermostability and enantioselectivity. This fact leads to the question where the source of these different preferences of the individual ene reductases comes from. Comparing the amino acid composition as well as the spatial arrangement of the various family members, it is noticeable that the differences between these enzymes are located especially in so-called flexible beta/alpha loop regions on the surface of the catalytic interface. The central question of this work is the influence of these surface loop regions on enzyme´s properties and the evolutionary relationship and development of such loop regions within this enzyme family. In the first approach four beta/alpha loop regions between five selected ene reductases were shuffled by using the semi-rational Golden Gate Shuffling method. Based on a developed photometric activity assay, a total of five loop shuffling variants were selected for the characterization of the substrate spectrum. This characterization has shown that the random simultaneous shuffling of up to four surface loop regions resulted in enzyme variants demonstrating compared to wild type NCR an increased reduction activity towards standard substrates. In the second approach the family of the Old Yellow Enzymes was divided into five homologous subfamilies by using phylogenetic analysis based on the overall sequence identity. One of these subfamilies was investigated in more detail with regard on the occurrence, as well as the evolutionary relationship of surface loops. For this purpose two surface loops, Loop A and Loop B, in three different ene reductases were defined by a sequence-based secondary structure prediction. The generation of Hidden Markov loop profiles led to the conclusion that beta/alpha surface loops are composed of conserved, as well as variable amino acid positions and that individual family members can be assigned to certain loop profiles. Additionally to that Hidden Markov loop profiles pointed out that the presence of a common loop region at two different ene reductases is not depending on the overall sequence identity. Two widely related family members could exhibit the same loop profile. In the third approach the question, whether the loop length and/or the amino acid composition of a loop area possess a significant influence on the properties of an enzyme was addressed by the development of a rational loop design method. Therefore, a total of seven loop variants of the two structurally defined loop regions A and B of NCR from Z. mobilis were designed. The crystal structure determination of one of the loop grafting variants revealed that the exchange of loop regions led to changes that affect the complete enzyme structure. Furthermore, it was shown by the seven rational variants that both, the amino acid composition as well as the loop length of surface loops of TIM barrel proteins possess a significant effect on the properties of an enzyme. Thus, in contrast to Loop B changes in the Loop A region in length or amino acid composition led to a decreased stability of the enzyme. Additionally, it could be shown that it was possible to transfer properties of one enzyme to another by the grafting of surface loop regions, for example the cis/trans substrate specificity. In summary, the present work could demonstrate that TIM barrel based enzymes are able to tolerate large structural as well as sequential alterations within their surface loops without losing their catalytic activity. Based on the results obtained within this thesis it could be concluded that beta/alpha surface loop regions of Old Yellow Enzymes are representing "Enzyme Modifying Elements" that possess a significant influence on the properties of the entire enzyme. Furthermore, it was also shown for the first time that surface loops can be assigned to specific loop profiles consisting of conserved and variable regions. Based on the acquired understanding of the influence of loop regions on enzyme properties, it should in the near future be possible to create a tailor-made reductase with desired properties by rational loop design.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Flavin-abhängigen En-Reduktasen der Old Yellow Enzyme Familie, die aufgrund der Architektur ihres aktiven Zentrums eine trans-Hydrierung von aktivierten C=C Doppelbindungen mit absoluter Stereospezifität katalysieren. Als strukturelles Grundgerüst besitzen alle Familienmitglieder ein Fass gebildet aus acht parallelen beta-Faltblätter, die mittels Loops mit acht umgebenden alpha-Helices verbunden sind. Trotz großer struktureller, sowie sequenzieller Gemeinsamkeiten, weisen die einzelnen Familienmitglieder deutliche Unterschiede bezüglich Substratspezifität, Thermostabilität und Enantioselektivität auf. Daraus ergibt sich die Frage, worin der Ursprung dieser unterschiedlichen Präferenzen der einzelnen En-Reduktasen begründet liegt. Vergleicht man nun dazu die Aminosäurezusammensetzung, sowie die räumliche Struktur der verschiedenen Familienmitglieder, fällt auf, dass sich diese Enzyme vor allem in sogenannten flexiblen beta/alpha Loopregionen an der Oberfläche des katalytischen Interface unterscheiden. Die zentrale Frage die sich nun stellt, und die in dieser Arbeit mittels drei verschiedenen Ansätze beantwortet werden soll ist, welchen Beitrag diese oberflächlichen Loopregionen für die Eigenschaften eines Enzymes leisten, sowie ob sich eine evolutive Entwicklung der Loopregionen erkennen lässt. Im ersten Ansatz ist es mittels der Methode des semi-rationalen Golden Gate Shufflings gelungen vier Loopregionen zwischen fünf ausgewählten En-Reduktasen simultan zu durchmischen. Basierend auf einem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten, photometrischen Aktivitätsassay wurden fünf Loopaustausch Varianten ausgewählt, die hinsichtlich ihres Substratspektrums charakterisiert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass durch das zufällige, simultane Austauschen von bis zu vier Loopregionen Enzymvarianten erhalten wurden, die im Vergleich zum NCR Wildtyp eine erhöhte Reduktaseaktivität gegenüber Standardsubstraten zeigten. Im zweiten Ansatz wurde die Familie der Old Yellow Enzyme mittels phylogenetischer Analysen basierend auf der Gesamtsequenzidentität in fünf homologe Unterfamilien unterteilt. Eine dieser Unterfamilien wurde hinsichtlich des Auftretens und der evolutiven Zusammenhänge von Oberflächenloops genauer untersucht. Dazu wurden in insgesamt drei En-Reduktasen je zwei Loopregionen durch Sekundärstrukturvorhersage bestimmt, Loop A und Loop B. Es konnte mittels der Erstellung von Hidden Markov Loop Profilen gezeigt werden, dass sich Loops aus konservierten, sowie variablen Aminosäuren zusammensetzen und dass sich einzelne Familienmitglieder bestimmten Loop-Profilen zuordnen lassen. Anhand der Loop-Profile wurde auch deutlich, dass das Vorkommen eines gemeinsamen Loopbereiches bei zwei verschiedenen En-Reduktasen nicht abhängig ist von der Gesamtsequenzidentität der beiden. Im dritten Ansatz wurde mittels der Entwicklung einer rationalen Loopdesign Methodik untersucht, ob die Looplänge sowie die Aminosäurezusammensetzung eines Loopbereiches einen entscheidenden Einfluss auf die Eigenschaften eines Enzyms ausübt. Dazu wurden insgesamt sieben rationale Loopvarianten der beiden strukturell definierten Loopbereiche A und B von NCR aus Z. mobilis erstellt. Die Kristallstrukturaufklärung einer Loopaustauschvariante brachte die Erkenntnis, dass der Austausch von Loopregionen zu Veränderungen führt, die die ganze Enzymstruktur betreffen. Des Weiteren konnte anhand der sieben rationalen Loopvarianten gezeigt werden, dass sowohl die Aminosäurezusammensetzung, als auch die Looplänge der beta/alpha Loops von TIM barrel Enzymen einen deutlichen Effekt auf die Eigenschaften eines Enzyms haben. So haben im Gegensatz zu Loop B Veränderungen im Loop A zu einer verminderten Stabilität des Enzymes geführt. Es konnte auch gezeigt werden, dass man anhand des Loopaustausches Eigenschaften von einem Enzym auf ein anderes übertragen kann wie zum Beispiel die cis/trans Substratspezifität. Zusammenfassend konnte anhand der hier vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass TIM barrel basierte Enzyme große strukturelle, wie auch sequentielle Änderungen in ihren Oberflächenloops tolerieren können ohne ihre katalytische Aktivität zu verlieren. Man kann dank der in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse folgern, dass es sich bei beta/alpha Oberflächenloops von Old Yellow Enzymes um „Enzym modifizierende Elemente“ handelt, die einen deutlichen Einfluss auf die Eigenschaften des gesamten Enzyms haben. Außerdem wurde ebenfalls zum ersten Mal gezeigt, dass sich Oberflächenloops bestimmten Loop-Profilen zuordnen lassen und aus konservierten, sowie variablen Bereichen bestehen. Dank des hier erlangten Verständnisses des Einflusses von Loopregionen auf Enzymeigenschaften sollte es in naher Zukunft möglich sein anhand der designten Loopbereiche eine Reduktase mit gewünschten Eigenschaften rational zu erstellen.