The proteasome activator Blm10 facilitates nuclear import of mature proteasome core particles in yeast

Abstract

The proteasome is a multi-subunit protease complex which is responsible for the degradation of misfolded and short-lived proteins. It exists in different configurations that all contain the proteolytically active core particle (CP) but differ in the number of associated regulatory particles (RP) and accessory proteins. The localization and configuration of proteasomes are highly dynamic. The regulation of both these factors is not only relevant for the function and activity of proteasomes but also represents a cellular adjustment mechanism to changing environmental conditions. In proliferating yeast cells, proteasomes are primarily localized to the nucleus (Russell et al., 1999; Laporte et al., 2008). When cells reach stationary phase, RP-CP assemblies dissociate and RP and CP are sequestered separately into cytosolic proteasome storage granules (PSGs) (Bajorek et al., 2003; Laporte et al., 2008). These motile cytosolic structures were found to resolve rapidly when cells resume proliferation and the proteasome is re-imported into the nucleus (Laporte et al., 2008). This work shows that the sequestration of the proteasome CP is dependent on the conserved proteasome activator Blm10. Blm10 consists of 32 HEAT-like repeats and is structurally related to transport factors (Sadre-Bazzaz et al., 2010; Huber & Groll, 2012). In addition to CP sequestration, Blm10 was identified in this study to be essential for the fast nuclear re-import of CPs upon PSG dissolution. Reconstitution of nuclear import of yeast CP into Xenopus egg nuclei and solution binding assays suggest that Blm10 facilitates nuclear import of mature CPs by mediating the contact of the CP-Blm10 complex to proteins of the NPC. Furthermore, Blm10 interacts in vitro with Gsp1-GTP, the yeast homologue of Ran-GTP, through its C-terminal region.This association of Gsp1-GTP to the Blm10-CP complex results in the dissociation of the complex and in the release of the CP. Taken together these results suggest that in yeast, Blm10 represents the importin for mature CPs.

Das Proteasom ist ein Proteasekomplex, welcher für die Degradation fehlgefalteter und kurzlebiger Proteine essentiell ist. Proteasomen existieren in verschiedenen Konfigurationen. Der Kern jeder Konfiguration wird vom 20S Kernkomplex (CP) gebildet, an welchen der 19S regulatorische Partikel (RP), andere Proteasomaktivatoren oder auch Proteasom-assoziierte Proteine binden können. Die intrazelluläre Lokalisation und die Konfiguration von Proteasomen sind dynamisch. Die Regulation beider Faktoren ist nicht nur für die Proteasomfunktion von Relevanz sondern stellt auch einen Anpassungsmechanismus der Zelle an verschiedene Umweltbedingungen dar. In teilenden Hefezellen liegen 80% der Proteasomen im Zellkern vor (Russell et al., 1999; Laporte et al., 2008) und die vorherrschende Proteasomkonfiguration stellen RP-CP oder RP-CP-RP Komplexe dar, welche essentiell für die Degradation polyubiquitinierter Proteine sind (Bajorek et al., 2003). Wenn Hefezellen jedoch die stationäre Wachstumsphase erreichen, verändern sich sowohl Konfiguration als auch Lokalisierung der Proteasomen. RP-CP Komplexe dissozieren in freie RPs und CPs und liegen in cytosolischen Granuli (PSG) vor (Bajorek et al., 2003; Laporte et al., 2008). Diese Granuli stellen motile Strukturen dar, welche rasch aufgelöst werden, wenn die Zellproliferation wiederaufgenommen wird (Laporte et al., 2008). In PSG gespeicherte Proteasomen werden dabei innerhalb weniger Minuten in den Kern importiert (Laporte et al., 2008). Diese Arbeit zeigt, dass die Sequestrierung von Proteasom Kernkomplexen in die PSGs abhängig von Blm10 ist. Blm10 ist ein konservierter Proteasomaktivator, welcher an CPs assoziieren kann. Blm10 besteht aus 32 HEAT-repeats und ist somit strukturell mit Transportfaktoren verwandt (Sadre-Bazzaz et al., 2010; Huber & Groll, 2012). Der schnelle Import von maturierten CPs in den Zellkern, der nach dem Auflösen der PSGs statt findet, ist ebenso abhängig von Blm10. Während des Transports des Blm10-CP Komplexes in den Zellkern vermittelt Blm10 den Kontakt zu Proteinen der Kernpore und interagiert im Kern mit Gsp1-GTP, dem Hefehomolog von Ran-GTP. Die Bindung von Blm10 an Gsp1-GTP erfolgt über den C-Terminus von Blm10 und hat die Dissoziation des Blm10-CP Komplexes zur Folge. Blm10 stellt somit das erste identifizierte Importin für den maturierten Kernkomplex dar.