Untersuchungen zur Bestimmung des inhärenten katalytischen Potentials von Metall-bindenden Enzymen

Abstract

In der hier vorgestellten Arbeit sollte, beispielhaft an zwei Modell-Systemen, untersucht werden ob und inwieweit man das katalytische Potential von Metalloenzymen nutzen kann, um alternative, sogenannte promiskuitive Reaktionen zu katalysieren. Dabei teilten sich die beiden Modell-Systeme, die Eisen-bindende Taurin Dioxygenase (TauD) und die artifizielle Kupfer-bindenen tHisF Varianten, eine HisHisAsp Triade als gemeinsames Strukturmotiv für die Koordination der Metallionen Eisen bzw. Kupfer. Es konnte gezeigt werden, dass die natürliche Hydroxylierungsreaktion der TauD genutzt werden kann, um Carbonsäuren, die strukturell ähnlich zu den natürlichen Substraten sind, in a-Position zu den entsprechenden a-Hydroxy-Carbonsäuren zu hydroxylieren. Dabei verlief die Hydroxylierung im Falle des Modellsubstrats b-Alanin mit guter Enantioselektivität zur Bildung von D-Isoserin mit einem ee-Wert von 96 % bei einem mäßigen Umsatz von 22,6 ± 0,7 %. Weiterhin konnten analoge w-Aminocarbonsäuren der Kettenlänge C4 - C6 mit dem TauD Wildtyp umgesetzt werden, wobei diese sowohl in Umsatz als auch ee-Werten der entsprechenden Produkte deutlich unter denen des b-Alanins lagen. Anhand Struktur-basierter Untersuchungen konnte eine Variante der TauD erstellt werden, welche sowohl in Bezug auf Umsätze (Steigerung des Umsatzes von b-Alanin von 22,6 ± 0,7 auf 54,2 ± 3,8 %) als auch Enantioselektivitäten (10 ± 1 % auf > 96 % bei g-Aminobuttersäure) bezüglich der getesteten Substrate signifikant verbesserte Eigenschaften gegenüber dem Wildtyp aufwies. Die Untersuchungen zur katalytischen Promiskuität zeigten, dass während TauD zur Katalyse alternativer Reaktionen wenig geeignet war und keine bzw. nur geringe Umsätze bezüglich der getesteten Modellreaktionen zeigte, tHisF mit zwei getesteten Modellreaktionen (der Michael-Addition und der Aldolreaktion) Umsetzungen zeigte. Jedoch konnte in weiterführenden Untersuchungen gezeigt werden, dass das artifizielle Metallzentrum der tHisF nicht an der Katalyse der entsprechenden Reaktionen beteiligt ist. So konnte im Falle der Michael-Addition gezeigt werden, dass die Reaktion weitgehend ohne Beteiligung des Enzyms sowie ohne Beteiligung des entsprechenden Metalls ablief. Die Aldolreaktion hingegen wird, analog zu entsprechenden Organokatalysatoren, von Lysin-Aminosäure-Seitenketten der tHisF katalysiert, welche sich an der Oberfläche des Enzyms befinden. Dies konnte anhand von Experimenten mit verschiedenen Varianten der tHisF, bei denen unterschiedliche mögliche reaktive Zentren per Mutagenese ausgeschaltet wurden, ermittelt werden.

In the work presented here, the catalytic potential of metal-binding enzymes concerning alternate, so-called promiscuous reactions, should be evaluated. Therefore, a case study with two different metal binding enzymes, the iron-binding taurine dioxygenase (TauD) and the artificially metal-binding tHisF variants formerly created by Reetz and his coworkers have been assayed in the catalysis of different model-reactions. Both enzymes share a common HisHisAsp motif for the coordination of the metals iron/copper. It was found that the natural catalytic machinery of the TauD could be utilized to hydroxylate carboxylic acid substrates that are structurally related to the natural ones, but chemically distinct at their a-position adjacent to the carboxylic acid. The hydroxylation reaction with the model substrate yielded product at a total conversion rate of 22.6 ± 0.7 % with an enantiomeric excess of >96 % of the corresponding product. Furthermore, higher homologues of the tested w-amino-carboxylic acid with chain lengths of C4 - C6 could also be converted by the wild type TauD, although at significantly lower rates and with lower enantiomeric excess in the products formed. Based on the available structure, mutants were created and one variant was found to display significantly increased conversions for all substrates (e.g. b-alanine conversion increased from 22.6 ± 0.7 to 54.2 ± 3.8 %) tested, as well as increased ee-values for those substrates previously not showing a pronounced enantiomeric excess (10 ± 1 % to > 96 % ee for g-aminobutyric acid conversion). Investigations on the catalytic promiscuity have shown that, as no significant catalytic effect for the reactions tested, could be observed for the TauD, the tested reaction setup using the artificially copper-binding tHisF gave conversion for two of the tested reaction types, namely the Michael addition and the aldol reaction. Thus further investigations did show, that for none of the reactions tested the artificial metal centre was involved in catalysis. Furthermore, the enzyme itself seems not to be involved in the catalysis of the Michael addition that gave significant conversions. For the aldol reaction, mutational studies did show that the reaction was catalyzed by lysine amino acid side chains, similar to what is reported for classical organocatalysis. This conclusion was possible after having identified different possible reactive centres and creating knock out mutants on all of these putative reactive centres, leaving the lysine residues as the only possible reactive site.