Development of zinc finger methyltransferase fusion proteins for targeted DNA methylation and gene silencing in human cells

Abstract

Epigenetic modifications such as DNA methylation and histone modifications play important roles in the regulation of gene expression. DNA methylation occurs at C5 position of cytosine residues mainly in CpG dinucleotides. In the human genome, about 70% of the CpGs are methylated. Most of the gene promoters are accompanied by CpG islands (regions rich in CpG dinucleotides) and methylation in these regions is inversely correlated with gene expression. Aberrant DNA methylation at the promoter region leads to variety of diseases including cancer. In the present study, we used catalytic domains of the Dnmt3a DNA methyltransferase and the GLP H3K9me3 lysine methyltransferase to silence two important oncogenes by targeted methylation. Zinc-finger proteins with predefined specificity were used as the targeting device. The first target gene was the vascular endothelial growth factor A (VEGF-A), which plays an important role in the vasculogenesis and angiogenesis. A zinc finger (VAZF) binding to the VEGF-A promoter was fused to either the catalytic domain of Dnmt3a (VAZF-Dnmt3aC) or to a fusion of Dnmt3a with its stimulator Dnmt3L (VAZF-Dnmt3a3Lsc). After transient transfection in ovarian cancer cells and magnetic activated cell sorting (MACS), we observed 25% methylation of the target region in the cells transfected with VAZF-Dnmt3aC and 49% in VAZF-Dnmt3a3Lsc transfected cells. VEGF-A expression was measured by quantitative -RTPCR and we observed a 36% reduction of VEGF-A expression in the cells that were transfected with VAZF-Dnmt3aC, and 56% in VAZF-Dnmt3a3Lsc transfected cells. However, transfection yields after MACS were only around 60-80% in these studies such that untransfected cells were still present. The second target gene of my study was the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), which is a transmembrane glycoprotein and is required for homophilic cell-cell adhesion. EpCAM is overexpressed in numerous cancers and its expression is inversely correlated with the promoter methylation status. In the present study, I used a zinc finger binding to the EpCAM promoter region, fused to the catalytic domain of the Dnmt3a DNA methyltransferase (EpZF-Dnmt3aC) for targeted methylation of the EpCAM promoter. After magnetic activated cell sorting, transfection yields of 60-80% were reached. With this approach 29% DNA methylation was achieved at the EpCAM promoter region in SKOV3 ovarian cancer cells. In stable cell lines expressing EpZF-Dnmt3aC, the methylation reached up to 48% which in turn led to 80% reduction of EpCAM protein expression. I also observed a reduction of cell proliferation in these stable cell lines which is a promising result suggesting that EpCAM repression might be an approach in cancer treatment. To improve the efficiency of gene delivery into the ovarian cancer cells, recombinant adenoviral vectors encoding the zinc-finger fused DNA methyltransferases and histone H3K9me3 methyltransferase catalytic domain were generated. Using adenovirus mediated gene delivery we achieved 53% methylation and 80% gene suppression at the VEGF-A promoter in SKOV3 ovarian cancer cells. Similarly, the zinc finger fused to GLP resulted in appearance of H3K9me3 at the promoter and 64% gene repression. At the EpCAM promoter, an EpCAM zinc finger fused to DNA methyltransferases led to 32% of methylation and 90% gene repression in the same ovarian cancer cells. Another important objective of the study was to measure the stability of DNA methylation and gene silencing of VEGF-A. After infection of SKOV3 ovarian cancer cells with adenovirus expressing VAZF-Dnmt3aC or VAZF-GLP, the methylation and gene expression was measured at different time points. In the cells that were infected with VAZF-Dnmt3aC constructs, establishment of DNA methylation was initiated 24 h after infection. The methylation reached to a maximum after five days, but surprisingly afterwards DNA methylation gradually declined to its basal level till day 15. VEGF-A supression correlated with the methylation levels, five days after infection 75% suppression of VEGF-A was observed which gradually declined to 8% after 15 days. In SKOV3 cells that were infected with recombinant adenoviral vectors encoding VAZF-GLP, H3K9 histone methylation peaked at day 5, but like the DNA methylation it gradually was lost afterwards. This result indicates that both silencing marks could not be introduced in a stable manner. As it was shown that DNA methylation and histone methylation acts synergistically, we measured DNA methylation after targeted introduction of histone H3K9 methylation and vice versa. However, in both the experiments we could not observe synergistic effects at the VEGF-A promoter. We started experiments to measure whether the decreased VEGF-A and EpCAM expression has an anti-tumor effect in a mouse model, which will explore the therapeutic potential of targeted methylation in cancer treatment.

Epigenetische Modifikationen, wie beispielsweise DNA-Methylierung und Histon Modifikationen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression. Im menschlichen Genom ist Cytosin am C5 hauptsächlich in CpG Dinukleotiden methyliert, wobei ca. 70% der CpGs DNA-Methylierung aufweisen. Die meisten Genpromotoren enthalten eine sogenannte CpG Insel (Regionen welche viele CpG Dinukleotide enthalten). Die DNA Methylierung dieser Regionen ist invers korreliert mit der Genexpression. Eine veränderte DNA Methylierung in Promoterregionen wird mit einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Krebs, in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit wurden DNA Methyltransferasen und die katalytische Domäne der GLP H3K9me3 Lysine Methyltransferase verwendet, um durch zielgerichtete Methylierung die Expression von zwei wichtigen Onkogenen stillzulegen. Dafür wurden Zink-Finger Proteine mit vordefinierter Spezifität verwendet, die jeweils eine Bindung an die Zielsequenz ermöglichen. Das erste Zielgen dieser Arbeit war der „vascular endothelial growth factor A“ (VEGF-A), welcher eine wichtige Rolle in der Vaskulagenese und Angiogenese spielt. Ein Zink-Finger (VAZF) welcher an den VEGF-A Promotor bindet, wurde entweder an die katalytische Domäne von Dnmt3a (VAZF-Dnmt3aC) oder an eine Fusion von Dnmt3a mit ihrem Stimulator Dnmt3L (VAZF-Dnmt3a3Lsc) fusioniert. Nach transienter Transfektion von Ovarienkrebszellen und magnetic activated cell sorting (MACS) konnte in den Zellen welche mit VAZF-Dnmt3aC transfiziert wurden, eine Methylierung von 25% an der Zielregion und in Zellen, welche mit VAZF-Dnmt3a3Lsc transfiziert wurden, eine 49% Methylierung beobachtet, werden. Die Expression von VEGF-A wurde mit quantitativer-RTPCR gemessen und es konnte eine 36% Reduktion von VEGF-A in Zellen beobachtet welche mit VAZF-Dnmt3aC transfiziert wurden. Transfektion mit VAZF-Dnmt3a3Lsc führte zu einer 56%igen Abnahme der VEGF-A Expression. Jedoch betrug die Transfektionseffizienz in dieser Arbeit, auch nach MACS nur ungefähr 60-80%, so dass untransfizierte Zellen noch immer vorhanden waren. Das zweite Zielgen dieser Arbeit war das „epithelial cell adhesion molecule“ (EpCAM), ein transmembranes Glycoprotein, welches für homophile Zell-Zell- Adhäsion benötigt wird. EpCAM ist in vielen Krebserkrankungen überexprimiert und die Expression von EpCAM korreliert invers mit der Promotor Methylierung. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Zink-Finger Protein verwendet, um an die Promotorregion von EpCAM zu binden. Der Zink-Finger wurde an die katalytische Domäne der Dnmt3a DNA Methyltransferase (EpZF-Dnmt3aC) fusioniert, um die Methylierung des EpCAM Promotors zu erreichen. Nach MACS konnte eine Transfektionseffizienz von 60-80% erreicht werden. Mit diesem Ansatz konnte eine 29%ige DNA Methylierung an der EpCAM Promotorregion in SKOV3 Ovarienkrebszellen erzielt werden. In stabilen Zelllinien, welche EpZF-Dnmt3aC exprimieren, konnte ein Anstieg der DNA Methylierung auf 48% erreicht werden, was zu einer 80%igen Reduzierung der EpCAM Proteinexpression führte. Zudem wurde eine Reduzierung der Zellproliferation in den stabilen Zelllinien beobachtet. Dies ist ein vielversprechendes Ergebnis, das nahelegt, dass EpCAM Repression ein Ansatz in der Tumorbehandlung sein könnte. Um die Effizienz der Einbringung der Fusionsgene in die Ovarienkrebszellen zu erhöhen, wurden adenovirale Vektoren hergestellt, die Zink-Finger Proteine exprimieren, welche an die katalytischen Domänen der Dnmt3a DNA Methyltransferase und der GLP Histon H3K9me3 Methyltransferase fusioniert waren. Durch die adenovirale Infektion mit Viren welche VAZF-Dnmt3aC exprimieren, konnte eine 53%ige Methylierung und eine 80% Gensuppression am VEGF-A Promotor in SKOV3 Ovarienkrebszellen erreicht werden. Ähnliche Ergebnisse konnten mit den Zink-Finger Proteinen, welche an GLP-C fusioniert wurden, erzielt werden. Es konnte ein Zuwachs von H3K9me3 in der Promotorregion und eine 64%ige Genrepression beobachtet werden. Am EpCAM Promoter konnte mit Zink-Finger fusionierten Methyltransferasen eine 32%ige Methylierung erreicht werden, welche mit einer 90%igen Genrepression einherging. Eine weitere wichtige Fragestellung dieser Arbeit war, die Stabilität der DNA Methylierung und Repression von VEGF-A zu bestimmen. Nach Infektion von SKOV3 Ovarienkrebszellen mit den Adenoviren welche VAZF-Dnmt3aC oder VAZF-GLP exprimieren, wurde die Methylierung und die Genexpression zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. In den Zellen welche mit VAZF-Dnmt3aC Konstrukten infiziert wurden, konnte nach 24 Stunden eine Zunahme der DNA Methylierung beobachtet werden. Ein Maximum der Methylierung konnte nach 5 Tagen beobachtet werden. Überraschenderweise nahm die DNA Methylierung danach schrittweise wieder ab, bis nach 15 Tagen wieder ein basales Niveau erreicht wurde. Die VEGF-A Genrepression korrelierte mit der DNA Methylierung, da 5 Tage nach der Infektion eine 75%ige Hemmung der VEGF-A Expression beobachtet werden konnte aber die Expression anschließend wieder auf das Ausgangsniveau anstieg. Nach Infektion von SKOV3 Zellen mit Adenoviren, welche VAZF-GLP enthielten, konnte ebenfalls am 5. Tag ein Maximum der H3K9 Histonmethylierung gemessen werden, die dann analog zur DNA Methylierung schrittweise bis zum 10ten Tag wieder abnahm. Frühere Untersuchungen zeigten einen synergistischen Zusammenhang zwischen DNA Methylierung und Histon Methylierung. Daher wurde die DNA Methylierung nach erfolgter Histon H3K9 Methylierung und umgekehrt untersucht. Allerdings konnte in beiden Experimenten kein synergistischer Effekt am VEGF-A Promotor beobachtet werden. Außerdem wurden Experimente gestartet, um im Maus-Modell zu untersuchen, ob eine Reduktion der VEGF-A oder EpCAM Expression einen anti-Tumoreffekt hat. Dadurch könnte das therapeutische Potential von zielgerichteter Methylierung in der Krebsbehandlung gezeigt werden.