Studie zur Entwicklung eines neuen Biokatalysators zur Darstellung von vicinalen Aminoalkoholen

Abstract

Das Ziel der Biokatalyse ist der Einsatz von Enzymen in der chemischen Industrie, um großtechnische Verfahren nachhaltiger und umweltfreundlicher zu gestalten. Oft werden zur Herstellung von Bausteinen für Pharmazeutika oder Kosmetika metallabhängige oder Organokatalysatoren eingesetzt, die in ihrer Herstellung meist teuer und toxisch sind. Obwohl es bereits einige Enzyme gibt, die Anwendung finden, gibt es noch sehr viele Reaktionen, für die es noch kein enzymkatalysiertes Pendant gibt. Die Aufgabe der modernen Biokatalyse besteht also darin, Enzyme für neue nicht-natürliche Reaktionen zu entwickeln. Im Rahmen dieser Arbeit wird daher die Entwicklung eines neuen Biokatalysators für die Epoxidringöffnungsreaktion mit Aminen untersucht und studiert. Die dabei resultierenden vicinalen Aminoalkohole sind wichtige Zwischenprodukte für verschiedene Anwendungsgebiete der chemischen Industrie. Ihre chemische Herstellung basiert auf der Verwendung von teuren und toxischen Katalysatoren oder sie laufen nicht genügend selektiv ab. Eine Möglichkeit der Entwicklung neuer Enzyme für nicht-natürliche Reaktionen stellt die Nutzung bereits vorhandener katalytischer Zentren dar. Dies ist eine gute Option, da viele in der organischen Synthese verwendeten Aktivierungstriebkräfte, wie zum Beispiel Säurekatalyse, auch in Enzymen auffindbar sind. Die organische Chemie und das Enzymdesign finden so einen Kontaktpunkt, der im Zuge dieser Arbeit ausgenutzt werden soll. So wurden drei Ansätze entwickelt, von denen zwei auf der Nutzung bereits vorhandener katalytischer Zentren beruhen und die dritte auf dem computerbasierten de novo Enzymdesign. Es wurden zwei Enzyme ausgewählt, die bereits ein aktives katalytisches Zentrum zur Epoxidringöffnung mit Nukleophilen, wie Wasser oder Halogeniden, besitzen. Zum einen wurde die Halohydrindehalogenase aus Agrobacterium radiobacter AD1 ausgewählt, um das vorhandene Nukleophilspektrum um NH-Nukleophile, wie Amide, Amidine oder Harnstoff zu erweitern. Zum Anderen sollte das Nukleophilspektrum der Limonen-1,2-epoxidhydrolase aus Rhodococcus erythropolis DCL14 um primäre und sekundäre Amine erweitert werden. Die bestehende Konkurrenz eines neuen nicht-natürlichen Nukleophils zum Wassernukleophil sollte durch gezieltes Ändern der aktiven Taschen mittels site-directed mutagenesis und durch Immobilisationstechniken abgeschwächt oder unterdrückt werden. Allerdings führten die Reaktionen der Varianten der genannten Enzyme mit verschiedenen Epoxiden und den genannten NH-Nukleophilen nicht zum gewünschten Erfolg. Als dritter Ansatz diente die Verwendung der Rosetta Methode, die in Zusammenarbeit mit Dr. Sinisa Bjelic (University of Washington, Seattle, USA) benutzt wurde, um Enyzmmodelle in silico zu erstellen, welche gewünschte Eigenschaften für die bimolekulare Epoxidringöffnungsreaktion enthielten. Die gewählten Substrate 3-Nitrostyroloxid und 3,4-Chloromethoxyanilin zeigten bereits eine geringe unselektive Hintergrundreaktion, deren Aktivität und Selektivität durch die Verwendung von de novo Enzymen gesteigert werden sollte. Sechs der 13 synthetischen de novo Gene konnten exprimiert und aufgereinigt werden. Gegenüber der Wunschreaktion zeigten sie allerdings keine Aktivität. Mittels STD-NMR konnte gezeigt werden, dass die gewählten Substrate an eines der Enzyme binden, allerdings konnte keine Aussage darüber getroffen werden, ob sie in der aktiven Tasche binden. Eine anschließende Untersuchung der verwendeten Übergangszustände gab Aufschluss über die nicht vorhandene Aktivität. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit die auftretenden Schwierigkeiten des Enzymdesigns für neue nicht-physiologische Reaktionen gezeigt werden. Es konnte zwar kein neuer Biokatalysator für die Epoxidringöffnungsreaktion mit Aminen entwickelt werden, jedoch zeigten die Untersuchungen die Schwachstellen auf, die nun in zukünftigen Arbeiten in diesem Gebiet umgangen werden können.

The goal of the biocatalysis is the application of enzymes in chemical industry, to make larger-scale processes sustainable and more environmentally friendly. Often metal dependent or organo catalysts are used for the manufacturing of building blocks for pharmaceuticals or cosmetics. These are usually expensive or toxic in their production. Although there are certain enzymes already used in industry, this field is restricted since there are many reactions which don’t have an enzymatic pendant. Therefore the assignment of biocatalysis is the development of enzymes for new non-physiological reactions. Within this work the development of a new biocatalyst for the epoxid ring opening reaction with amines is to be examined and studied. The ring opening reaction with amines give vicinal amino alcohols, moieties used as a key structure in a large group of molecules, like alkaloids, chiral auxiliaries or pharmaceuticals. These amino alcohols are prepared by various synthetic approaches. However, these are generally carried out with large excess of amines at elevated temperatures and are often accompanied by poor selectivity. Although several modified procedures have been reported for the ring opening of epoxides with amines, no enzymatic activity towards this reaction has been described yet. One possibility of the development of enzymes for new non-natural reactions is the utilization of already existing enzymatic centers. Although this possibility is not used very often yet it is a plausible option since used forces for activation in chemistry, like acid catalysis, can also be found in enzymes. This connection between enzyme design and organic synthesis is outlined within this work. Two approaches are based on the utilization of existing catalytical centers and a third approach is based on the computational de novo enzyme design. Two enzymes are chosen which already have an existing catalytical center for the epoxide ring opening reaction with different nucleophiles like water, halides or pseudohalides. On the one hand the halohydrin dehalogenase from Agrobacterium radiobacter AD1 was chosen to enlarge its nucleophile spectrum by NH-nucleophiles like amides, amidines or urea. On the other hand also the nucleophile spectrum of the limonene-1,2-epoxide hydrolase from Rhodococcus erythropolis DCL14 was to be expanded by primary and secondary amines. The active site was targeted specifically by site-directed mutagenesis and an immobilisation technique was used to weaken or avoid the exisiting dominance of water, which acts as natural nucleophile. The usage of the stated NH-nucleophiles with different kinds of epoxides was for both enzymes not successful. As a third approach the Rosetta methodology was used in collaboration with Dr. Sinisa Bjelic (University of Washington, Seattle, USA) to design in silico enzyme models containing active sites with the desired properties for the epoxide ring opening. The chosen substrates 3,4-chloromethoxy aniline and 3-nitrostyrene oxide already show a low non-selective background conversion, whose activity and selectivity should be increased by the usage of the de novo designed enzyme. Although six out of 13 ordered synthetic de novo genes could be purified none of them showed any activity towards the desired reaction. Further characterization by STD-NMR showed that both substrates are binding to one chosen enzyme but it was not clear if it bound to the right position. The examination of the used transition state gave information about a possible reason for the missing activity. As concluding remark this work shows the difficulties of the enzyme design for new non-natural reactions. Although there was no new biocatalyst for the epoxide ring opening with amines weak points could be shown which now can be avoided in future work in this area.