Untersuchungen zur Substratspezifität und Enantioselektivität mikrobieller Hydantoinasen

Abstract

Im Mittelpunkt der Untersuchungen stand die Hydantoinase aus Arthrobacter aurescens DSM 3745. Für die Standardumsetzung von 5-Benzylhydantoin wurden die spezifische Aktivität und die Enantioselektivität ermittelt und mit anderen Hydantoinen bzw. hydantoinanalogen Substanzen verglichen. Die Enantioselektivität der Umsetzung von 5-Benzylhydantoin zeigte weder eine Abhängigkeit von der Temperatur noch vom pH-Wert. Bei Hydantoinen mit Ethylgruppen wie 5-(Methylthioethyl)-hydantoin und 5-(Phenylethyl)-hydantoin konnte für diese Hydantoinase eine Umkehrung der Enantioselektivität festgestellt werden. Der gleiche Effekt konnte beim Austausch der Phenyl- gegen eine Trimethylsilygruppe gefunden werden. 5-(Trimethylsilyl)-hydantoin wurde D-spezifisch mit einer Enantioselektivität von E > 100 umgesetzt. Um den Einfluß einzelner Strukturelemente im Hydantoinring zu untersuchen, wurden verschiedene Hydantoinanaloga synthetisiert. 5-Benzyl-1,3-oxazolidin-2,4-dion, welches ein Sauerstoffatom anstelle der 1-NH-Gruppe besitzt, wurde von der Hydantoinase aus Arthrobacter aurescens DSM 3745 mit einer geringen Aktivität D-selektiv zu Carbamoylphenylmilchsäure umgesetzt. Benzylsuccinimid, welches eine Methylengruppe anstelle der 1-NH Gruppe trägt, wurde mit einer sehr geringen Aktivität zu D-3-Benzylbernsteinsäurehalbamid umgesetzt. 3-substituierte Hydantoinanaloga wurden nicht als Substrate akzeptiert. Benzylbernsteinsäurehalbamid zeigte auf Umsetzungen mit der Hydantoinase aus Arthrobacter aurescens DSM 3745 einen starken inhibitorischen Einfluß (Ki = 0.34 mM). Umsetzungen mit weiteren Hydantoinasen aus Bacillus thermoglucosidasius, Thermus species (beides rekombinante Enzyme aus Escherichia coli) und aus Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117 verliefen ausschließlich D-selektiv oder D-spezifisch. Alle Hydantoinanaloga wurden an derselben Position hydrolysiert wie das unveränderte Hydantoin.

Of primary concern in this study was the hydantoinase from Arthrobacter aurescens DSM 3745. For the standard conversion of 5-benzylhydantoin, the specific activity and the enantioselectivity were analyzed and compared with other 5-substituted hydantoins and hydantoin analogues. Neither temperature nor pH-value had a significant influence on the enantioselectivity of the conversion of 5-benzylhydantoin. Hydantoins with ethyl spacers like 5-(methylthioethyl)-hydantoin or 5-(phenylethyl)-hydantoin caused an inversion of the enzymatic enantioselectivity. The same effect was found using a trimethylsilyl group instead of the phenylgroup. 5-(trimethylsilylmethyl)-hydantoin was converted D-specifically with an enantioselectivity of E > 100. To clarify the influence of the ring positions on the substrate specificity and enantioselectivity, different hydantoin analogues were synthesized. 5-benzyl-1,3-oxazolidine-2,4-dion, which contains an oxygen-atom in the 1-position, was converted D-selectively with low activity to carbamoylphenyl lactic acid by the hydantoinase from Arthrobacter aurescens DSM 3745. Benzylsuccinimide, which contains a methylene group instead of the 1-NH group, was converted to D-3-benzylsuccinic acid mono amide with a high stereoselectivity and very low activity. No conversion could be detected for those hydantoin analogues which were substituted in the 3-position. Benzylsuccinic acid mono amide was found to be a strong inhibitor (Ki = 0.35 mM) for the conversion of L-5-benzylhydantoin with the hydantoinase from Arthrobacter aurescens DSM 3745. With D-hydantoinases from Bacillus thermoglucosidasius, Thermus species (both as recombinant enzymes produced in Escherichia coli) and from Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117, only D-selective or D-specific conversions were found. All hydantoin analogues were hydrolysed at the same position as the non-modified hydantoin.