Modellgestützte Analyse der Dynamik des Phosphofructokinase-Systems in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wird das Phosphofructokinase-1 und -2-System in S. cerevisiae hinsichtlich seiner dynamischen Eigenschaften unter in-vivo Bedingungen untersucht. Hierzu wurden glucoselimitierte kontinuierliche Kulturen von Saccharomyces cerevisiae durch das Auftragen eines extrazellulären Glucosepulses im stationären Zustand angeregt. In Antwort auf eine solche Anregung wurden Veränderungen der intrazellulären Metabolitkonzentrationen bzw. Enzymaktivitäten beobachtet, welche anhand modellgestützter Untersuchungen die Erfassung dynamischer Eigenschaften des betreffenden reaktionskinetischen Systems unter in-vivo Bedingungen ermöglichen. Nachweislich unterliegt Phosphofructokinase-1 im Cytosol den homologen und heterologen Protein-Protein-Wechselwirkungen. Durch diese Wechselwirkungen werden kinetische Eigenschaften des Enzyms signifikant beeinflußt. Es konnte gezeigt werden, daß die Phosphofructokinase-1 unter in-vivo Bedingungen nur vom positiven Effektor Fructose-2,6-bisphosphat (zu Signaltransduktionsebene) bzw. dem negativen Effektor MgATP (zum Energiestatus) beeinflußt wird. Die Phosphofructokinase-2 ist unter in-vivo Bedingungen durch die Substrate Fructose-6-phosphat und MgATP gesättigt. Ihre Aktivierung erfolgt somit ausschließlich über eine Phosphorylierung durch Proteinkinase-A. Die Übertragung des cAMP Signals auf die Phosphofructokinase-2 weist zwei charakteristische Eigenschaften auf: Zum einen liegt bei dieser Übertragung ein positiver Feed-back-Mechanismus vor zum zweiten weist die Übertragung des Signals über Proteinkinase-A ausgeprägte Hytereseeigenschaften auf. Demnach wird die Proteinkinase-A mit ansteigenden cAMP-Konzentrationen erst beim Erreichen einer kritischen Konzentration aktiviert. Danach nimmt die Signalübertragung seinen eigenen Lauf unabhängig vom weiteren Verlauf der Konzentration des cAMP. Dies ermöglicht der Zelle eine Autonomie und Entkopplung der Phosphofructokinase-2 Aktivität vom Eingangssignal des cAMP.

The work focuses on the phosphofructokinase-1 and -2-system dynamics in Saccharomyces cerevisiae, in vivo. The investigation strategy was built upon glucose pulse experiments, applied to glucose-limited continuous cultures of Saccharomyces cerevisiae, where response to an extracellular glucose pulse has been recorded within the pattern of intracellular metabolite concentrations respectively in vivo enzyme activities. Latter observation allowed an extensive in vivo analysis of dynamic characteristics of the phosphofructokinase system versus a mathematical modelling approach. It could be shown that particularly, phosphofructokinase-1 is subject to homologous respectively heterologous protein-protein-interactions in the cytoplasm, significantly affecting the kinetics of the enzyme. It could be also ascertained that phosphofructokinase-1, in vivo, could be only modulated significantly by the positive effector Fructose-2,6-bisphosphate (versus signal-transduction) respectively the negative effector MgATP (versus energy state). Phosphofructokinase-2, in vivo, is found to be saturated with respect to both substrates, F6P and MgATP. This fact consequently allows uncoupling of enzyme activity respectively the cAMP/protein-kinase-A/phosphofructokinase-2 signal transduction cascade from glycolytic flux. Accordingly activation of the phosphofructokinase-2 is exclusively a result of phosphorylation by proteinkinase-A. Signal processing from cAMP versus phosphofructokinase-2, also displays peculiar features implicated in a hysteresis behaviour: when increasing cAMP concentration achieves a certain critical value, protein kinase-A is switched into its active state. Posterior to this activation, the signal transform is autonomous and independent of further alterations of the intracellular cAMP concentration. During this recovery period, the cascade remains insensitive to cAMP. Consequently this mechanism allows signal processing in quantum of uniform signal modules.