Immobilisierung und Stabilisierung der Hydantoinase und L-N-Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens DSM 3747

Abstract

Hydantoinase-Verfahren gewinnen zunehmend an Bedeutung für die Herstellung enantiomerenreiner Aminosäuren. In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedlichste adsorptive und kovalente Methoden zur Immobilisierung einer Hydantoinase und L-N-Carbamoylase untersucht. Die Wildtypenzyme aus Arthrobacter aurescens wurden durch Zellaufschluß und Ammoniumsulfat-Fällung angereichert und nach Resuspendierung im geeigneten Puffersystem direkt immobilisiert. Allerdings konnten damit sowohl für die Hydantoinase als auch für die L-N-Carbamoylase nur geringe Aktivitäten erzielt werden, die zu gering waren, um industriellen Anforderungen gerecht zu werden. Mit der Bereitstellung der rekombinanten Enzyme war es möglich diese getrennt voneinander aufzureinigen, um den Einfluß unterschiedlicher Immobilisierungsparameter wie Protein-Träger-Verhältnis, Kopplungsmethode und Art des Trägermaterials systematisch zu untersuchen. Die Immobilisierung der L-N-Carbamoylase war nur über die Carboxylgruppen des Enzyms möglich, während die Oxiran-Methode zu einer Inaktivierung des Enzyms führte. Unter Verwendung eines hydrophilen Trägermaterials konnten Aktivitätsausbeuten von 100% und spezifische Aktivitäten bis zu 11 U/g Träger erzielt werden. Die rekombinante Hydantoinase ließ sich relativ problemlos mit spezifischen Aktivitäten von 3 U/g Träger sowohl an Epoxid- als auch an primäre Aminogruppen koppeln. Durch Lagerung in manganhaltigem Puffer war darüberhinaus eine Hyperaktivierung des Immobilisates um das 5-fache möglich. Alternativ zur kovalenten Kopplung der Enzyme wurde die Metallaffinitätschromatographie für die spezifische Bindung rekombinanter His6-tag Proteine direkt aus dem Rohextrakt untersucht. Die Ermittlung der Prozeßstabilität ergab Halbwertszeiten von 14000 h (Hydantoinase) bzw. 1000 h (L-N-Carbamoylase). Die pH- und Temperaturoptima waren für die immobilisierte Hydantoinase und L-N-Carbamoylase vergleichbar, so daß ein Einsatz unter denselben Reaktionsbedingungen möglich ist.

The hydantoinase process is of raising interest with respect to the production of enantiomerically pure amino acids. In the present work, different adsorbtive as well as covalent methods have been investigated for the immobilization of hydantoinase and L-N-carbamoylase. The wildtype enzymes from Arthrobacter aurescens were concentrated by cell disruption and ammoniumsulfate precipitation and directly immobilized after resuspension in a suitable buffer system. However, obtained activities of both, hydantoinase and L-N-carbamoylase were too low to fulfill industrial requirements. With the availability of the recombinant enzymes, it was possible to purify them seperately and to investigate systematically the influence of different parameters in the immobilization process such as protein-carrier-relation, coupling method and kind of support. Immobilization of the L-N-carbamoylase was only feasible via the carboxylic groups of the enzyme, while the oxirane coupling led to an inactivation. The use of an hydrophilic carrier resulted in activity yields of 100 % and specific activities of up to 11 U/g carrier could be obtained.Coupling of the recombinant hydantoinase turned out to be relatively simple and yielded specific activities of 3 U/g carrier. Storage in manganese containing buffer led to a 5-fold hyperactivation. As an alternative to covalent coupling, metal affinity chromatography was used for specific binding of recombinant his6-tag proteins directly from the crude extract. Determination of the operational stability revealed half life times of 14,000 h (hydantoinase) and 1,000 h (L-N-carbamoylase), respectively. Temperature-and pH-optima were comparable for the immobilized hydantoinase and L-N-carbamoylase, what enables operation under the same reaction conditions.