Molekulare Mechanismen der Antiöstrogenwirkung beim Mammakarzinom

Abstract

Antiöstrogene haben sich als sehr effektiv in der Behandlung hormon-responsiver Mammakarzinome erwiesen. Im Verlauf der Therapie kommt es jedoch in der Regel zu einem Verlust der anithormonellen Wirkung. Die an der Entstehung der Antihormonresistenz beteiligten Mechanismen sind weitgehend ungeklärt. Ein entscheidender Schritt zur Aufklärung der antihormonellen Wirkung war die Beobachtung, dass die Behandlung hormonsensitiver Mammakarzinomzellen zu einer Aktivierung des inhibitorischen Wachstumsfaktors TGFb führt. Am Modell-System hormon-sensitiver MCF-7 Mammakarzinomzellen wurde im Rahmen dieser Arbeit die Beteiligung des TGFb-Systems an der Wirkung des nicht-steroidalen, partiellen Antiöstrogens 4-Hydroxytamoxifen und des steroidalen, reinen Antiöstrogens ICI 182.780 untersucht. Die Ergebnisse sollen zum besseren Verständnis der Interaktionen zwischen Hormonen und Wachstumsfaktoren und den damit im Zusammenhang stehenden Mechanismen der Antiöstrogenresistenz beitragen. Im Mittelpunkt des ersten Teils der Arbeit stand die antiöstrogene Regulation des TGFb-Systems. Untersucht wurde die Expression der Liganden TGFb1 und TGFb2, der Rezeptoren TbRI und TbRII und von Smad7. Zur genauen Quantifizierung der mRNA-Expression dieser Gene wurden spezifische LightCycler RT-PCRs etabliert. Es konnte gezeigt werden, dass nicht nur TGFb2 sondern auch TbRII einer antihormonellen Regulation unterliegt. Die Stärke der Induktion beider Gene korrelierte mit der wachstumsinhibitorischen Wirkung der Antiöstrogene. Smad7 wurde nur schwach durch Antiöstrogen induziert, TGFb1 und TbRI gar nicht. Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht Aufschluss darüber zu erhalten, welche Zweige des komplexen TGFb Signaltransduktionssystems an der antiöstrogenen Wirkung beteiligt sind. Als Endpunkt wurde u.a. die Aktivierung TGFb-sensitiver Promotoren untersucht. Das Reporterplasmid p3TP-lux wurde durch Antiöstrogene ca. 2fach stärker aktiviert als durch TGFb. Über Koexpression dominant-negativer TGFb-Rezeptoren und dominant-negativer Smad4-Proteine konnte gezeigt werden, dass die anitöstrogene Aktivierung von p3TP-lux TGFb vermittelt ist und über den Smad-Signaltransduktionsweg verläuft. Obwohl das steroidale Antiöstrogen ICI 182.780 einen deutlich stärkeren Effekt auf das TGFb-System hat als das partielle Antiöstrogen 4-Hydroxytamoxifen, war die Aktivierung von p3TP-lux durch beide Antiöstrogene annähernd gleich stark. Für eine vollständige Aktivierung von p3TP-lux ist eine Kooperation zwischen einem TGFb aktivierten Smad-Komplex und c-Jun/c-fos notwendig. Die Induktion von c-fos wird jedoch durch steroidale Antiöstrogene blockiert und kommt daher als Ursache der geringen Induktion von p3TP-lux durch ICI 182.780 in Frage. Da TGFb seine Wirkung neben dem Smad-Signaltransduktionsweg auch über MAP-Kinase-Wege entfalten kann, wurde mit Hilfe spezifischer pharmakologischer Inhibitoren die Beteiligung des MEK/Erk- und des p38-MAP-Kinase-Weges an der antihormonellen Wachstumsinhibition untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der p38-Weg über die Induktion von TGFb2 und TbRII an der antihormonellen Wachstumsinhibition beteiligt ist. Zusammenfassend wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass Antiöstrogene verschiedene Gene des TGFb-Signaltransduktionssystems differenziell regulieren. Die Untersuchungen zur Beteiligung der TGFb-Signaltransduktionswege an der antihormonellen Wirkung weisen darauf hin, dass diese differenzielle Regulation, durch die spezifische Aktivierung einiger TGFb-Signaltransduktionswege (Smad, p38) und gleichzeitige Inhibition anderer (MEK/Erk) erreicht wird. Da die Signaltransduktionswege in unterschiedlichem Ausmaß zur Aktivierung der verschiedenen Promotoren beitragen, kommt es unter Antiöstrogeneinfluss zu einer Modifizierung des TGFb induzierten Genexpressionsmusters und der spezifisch antiöstrogenen Wirkung.

Antiestrogens are very effective in the treatment of hormone responsive breast tumors. A major drawback of antiestrogen treatment however is the development of antiestrogen resistance. The mechanisms leading to antiestrogen resistance are largely unknown. A great progress in the understanding of antiestrogen action was made by the observation, that antiestrogenic treatment of hormone sensitive breast cancer cells leads to an activation of the inhibitory growth factor TGFb. In this study hormone responsive MCF-7 breast cancer cells were chosen as model system to further elucidate the involvement of the TGFb signal transduction system in antiestrogen action. Both the nonsteroidal partial antiestrogen 4-hydroxytamoxifen and the steroidal antiestrogen ICI 182.780 were used. The results of this study will contribute to a better understanding of the interaction between hormones and growth factors and the associated mechanisms of antiestrogen resistance. The first part of the study was focussed on the antiestrogen induced regulation of the TGFb system. Expression of the ligands TGFb1 and TGFb2, the receptors TbRI and TbRII and Smad7 were analyzed. Specific LightCycler RT-PCRs were developed for quantification of these mRNAs. It was shown that both TGFb2 and TbRII are regulated by antiestrogens. The growth inhibitory potential of both antiestrogens was correlated with the induction of these mRNAs. Smad7 mRNA was only minimally induced under antiestrogen treatment, TGFb1 mRNA and TbRI mRNA remained unchanged. Furthermore it was analyzed, which parts of the complex TGFb signal transduction system participate in the mediation of antiestrogen action. Activation of TGFb responsive promoters was used as analytical endpoint. Antiestrogens induced the reporter plasmid p3TP-lux two times stronger than TGFb. Using a cooexpression system of dominant negative TGFb receptors and dominant negative Smad4 proteins it could be demonstrated, that the antiestrogen induction of p3TP-lux is mediated by TGFb via the Smad signal transduction pathway. ICI 182.780 has a more pronounced effect on the TGFb system than 4-hydroxytamoxifen. Unexpectedly however activation of p3TP-lux did not differ between these two substances. Cooperation between a TGFb activated Smad complex and c-jun / c-fos has been shown to be necessary for complete activation of p3TP-lux. Induction of c-fos is blocked by steroidal antiestrogens and is consequently thought to cause the only minimal induction of p3TP-lux by ICI 182.780. It has been previously shown that TGFb exerts its action not only by the Smad signal transduction pathway but also by MAP kinase cascades. Using specific inhibitors of the MAP kinases MEK and p38 evidence was obtained that p38 contributes to antihormonal growth inhibition via the induction of TGFb2 and TbRII. In conclusion, genes of the TGFb signaltransduction pathway are differentially regulated by antiestrogens. This differential regulation is mediated by the activation of some pathways (Smad, p38) and the inhibition of others (Erk). Thus in breast cancer cells antiestrogen treatment leads to a modification of the TGFb induced gene expression pattern by pathway specific promoter activation.