Herstellung von Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol aus Toluol: Konstruktion und Charakterisierung einer Mutante des Lösungsmittel tolerierenden Pseudomonas putida Idaho

Abstract

Zur biotechnologischen Produktion der Bulkchemikalie Phenol wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Mutante des Bakterienstammes P. putida Idaho konstruiert, mit welcher aus Toluol Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol als Precursor für die weitere Umsetzung zu Phenol hergestellt werden sollte. In P. putida Idaho ist das gewünschte Produkt Metabolit des Abbauweges von Toluol. Im Wildtypstamm P. putida Idaho wird Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol durch zwei Dehydrogenasen, die in verschiedenen Genclustern codiert sind, zu Brenzcatechin umgesetzt. Die Toluat-cis-1,2-dihydrodiol-Dehydrogenase XylL, die im meta-Operon codiert ist, wurde durch eine Deletion im Gen xylL inaktiviert, in Gen benD der Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol-Dehydrogenase des b-Ketoadipatweges wurde zusätzlich zu einer Deletion ein Antibiotikaresistensmarker, das W-Fragment, eingefügt. Mit dieser Mutante P. putida Idaho BDH2 wurden Umsatzexperimente von Toluol zu Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Mutante trotz Inaktivierung der beiden Gene, welche das Produkt in Wildtypstamm weiter abbauen, immer noch in der Lage ist, Toluol als Wachstumssubstrat zu nutzen. Aus dem angebotenen Toluol entstand außerdem nur 25-40 % des erwarteten Produktes, das nach etwa 4 Tagen unter weiterer Bildung von Biomasse wieder abgebaut wurde. Wurde statt Toluol Benzylalkohol oder Benzoat angeboten, wurde Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol zu nahezu 100 % gebildet. Auch während des Umsatzes dieser beiden Substrate konnte eine sehr schwache Zunahme der optischen Dichte beobachtet werden. Wie im Ansatz mit Toluol wurde auch in diesen Ansätzen das gebildete Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol nach einigen Tagen unter Wachstum der Zellen wieder abgebaut. Durch Enzymtests mit Rohextrakten der Doppelmutanten von P. putida Idaho konnte eine sehr schwache aber signifikante Aktivität eines Enzyms, das Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol umsetzen kann, nachgewiesen werden, was den Abbau des gebildeten Produktes erklärt. Ob die Bilanzlücke bei der Bildung von Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol aus Toluol allein dieser Aktivität zugrunde liegt, ist nicht geklärt. Ein zusätzlicher Abbauweg von Toluol in P. putida Idaho der nicht über die Metabolite Benzylalkohol und Benzoat geht, konnte nicht nachgewiesen werden. Es wurde gezeigt, dass die Mutante P. putida Idaho BDH2, deren Biomasse mit dem Substrat Glucose produziert wurde, sich nur sehr schlecht mit Toluol induzieren ließ. Eine technische Produktion von Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol mit P .putida Idaho ist, abgesehen vom unvollständigen Umsatz von Toluol ausgehend, weiterhin problematisch. Die Sequenzierung der beiden Gencluster mit den Dehydrogenasen zeigte, dass beide für den Umsatz zu Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol erforderlichen Dioxygenasen vorhanden waren. Die Gencluster aus P. putida Idaho zeigten Abweichungen von den sonst fast identischen Clustern, nämlich dem meta-Operon aus pWW0 und dem ß-Ketoadipatweg aus P. putida PRS2000. Diese Abweichungen könnten Hinweise auf eine andersartige Regulation für den Aromatenabbau als in den Wegen aus pWW0 oder P. putida PRS2000 bergen. Auch ist die Rekrutierung einer cis-1,2-Dihydrodiol-Dehydrogenase aus einem der beiden Gencluster an einen anderen Lokus des Chromosoms aus P. putida Idaho nicht ausgeschlossen.

In the present work a biocatalyst for the conversion of toluene to benzoate-cis-1,2-dihydrodiol is described. To establish a mutant strain of P. putida Idaho that accumulates benzoate-cis-1,2-dihydrodiol the genes for toluate dihydrodiol dehydrogenase (xylL) and benzoate dihydrodiol dehydrogenase (benD) that convert this product to catechol in the wild type strain were inactivated. Physiological studies with the mutant strain P. putida Idaho BDH2 revealed that it produces benzoate cis-1,2-dihydrodiol. However, it was found that it still can grow with toluene as sole carbon source despite the interruption of its degradative pathway. The yield of product when given toluene was approximately 40 %. When given benzyl alcohol or benzoate the conversion ratio was 100 % and only very little growth during the conversion phase was noticed. After the production of benzoate cis-1,2-dihydrodiol in all conversion experiments with toluene, benzyl alcohol or benzoate as substrates it was found that the product was degraded within two days accompagnied by growth of the bacteria. Enzyme tests for the benzoate cis-1,2-dihydrodiol dehydrogenase with crude extracts of cells of P. putida Idaho BDH2 grown with toluene and benzoate cis-1,2-dihydrodiol respectively revealed a weak but significant activity (5 x 10-3 U/mg protein). This activity demonstrates the existance of a third enzyme that is capable to convert benzoate cis-1,2-dihydrodiol. It is not clear yet if this weak activity is the only reason for the low yield of benzoate cis-1,2-dihydrodiol when the conversion experiment was performed with toluene as substrate. An additional degradation pathway to the oxydation of the methyl group of toluene could not be shown. The gene clusters encoding the two inactivated dihydrodiol dehydrogenases of P. putida Idaho were sequenced. Both bezoate dioxygenases necessary for the conversion to benzoatecis-1,2-dihydrodiol were present. The meta-operon was almost identical to that of pWW0. However, the in the last sequenced gene, xylQ, the similarity to the meta-operon decreased and was almost identical with a cluster from a naphthalene degradation pathway from P. stutzeri AN10. The proteins encoded by the ß-ketoadipate pathway show at least 93 % identical positions to a cluster reported in P. putida PRS2000. However, in P. putida Idaho an additional gene for the catechol-1,2-dioxygenase CatA could be found being positioned between a gene for BenK, a benzoate transporter and BenE whose function is unknown. The regulatory gene benR preceeding the degradation genes benABCDKE in P. putida PRS2000 could not be found in P. putida Idaho. The homology between the two gene clusters starts approximately 90 bases upstream of benA. This suggests that the cluster with benD is regulated by another enzyme, possibly XylS, which according to the literature, can replace BenR and vice versa.