Untersuchungen zum unkonventionellen Sekretionsweg des Zytokins Makrophagen-migrationsinhibierender Faktor (MIF)

Abstract

Der Makrophagen-migrationsinhibierende Faktor (MIF) wurde erst kürzlich als Hormon, proinflammatorisches Zytokin und Glucocorticoid-Regulator wiederentdeckt. MIF spielt eine wichtige Rolle beim septischen Schock, akuten und chronischen Entzündungskrankheiten sowie bei der natürlichen und der erworbenen Immunantwort. Obwohl MIF keine hydrophobe N-terminale Signalsequenz besitzt, wird es aus Monozyten/Makrophagen, T-Zellen, bestimmten Epithelzellen und endokrinen Zellen nach spezifischer Stimulation sezerniert. In der vorliegenden Arbeit wurden die biochemischen Eigenschaften von MIF als leaderless secretory-Protein untersucht, die subzelluläre Lokalisation in Monozyten beschrieben und der Export von MIF über einen alternativen, nicht-klassischen Sekretionsweg charakterisiert.

Intrazelluläres und nach LPS-Stimulation exportiertes MIF werden weder in typischen murinen noch in humanen immunregulierten Zellen N-glykosyliert, obwohl das Protein zwei potenzielle N-Glykosylierungsstellen besitzt. Nach in vitro-Translation wird MIF weder in Mikrosomen translokalisiert noch dort posttranslational modifiziert. MIF scheint also nicht in den klassischen ER-Golgi-Sekretionsweg einzutreten.

Der Export von neusynthetisiertem sowie vorgeformtem MIF folgt einer ähnlichen Kinetik. Diese bewirkt eine schnell einsetzende Ausschüttung bereits 2 h nach LPS-Stimulation, die für 7-8 h anhält. LPS scheint die MIF-Sekretion sowohl über die Transkription/Translation von MIF als auch über einen posttranslationalen Mechanismus zu stimulieren.

In Immunzellen colokalisiert MIF nicht mit bekannten Markern des klassischen Sekretionsweges. Eine partielle Colokalisation scheint es nur mit dem LLS-Protein PDI zu geben, das trotz seiner vorherrschenden Lokalisation im ER auch extrazellulär nachgewiesen wurde. Inhibitoren des klassischen Sekretionsweges wirken eher stimulierend als inhibierend auf den MIF-Export, der bei der Ausschüttung von vorgeformtem MIF einem energie-unabhängigen Mechanismus folgt. Es scheint ausgeschlossen, dass MIF über recycling endosomes aus der Zelle transportiert wird. Da aber die Sekretion von MIF durch einen Stimulator der Exocytose verstärkt und durch 18°C-Temperaturblock reduziert wird, assoziiert MIF möglicherweise mit Vesikeln des späten sekretorischen Transportweges.

Nocodazol, ein Inhibitor der Tubulin-Polymerisation, reduziert den MIF-Export über einen weiten Konzentrationsbereich, was darauf hinweist, dass für den Export ein intaktes Tubulin-Netzwerk notwendig ist. Andere Inhibitoren, die das Tubulin-Netzwerk der Zelle manipulieren, beeinflussen den MIF-Export dagegen nicht. Somit scheint Nocodazol spezifisch auf den alternativen Export von MIF aus der Zelle zu wirken.

Am Export von MIF sind ABC-Transporterproteine beteiligt, die unabhängig von einer konstanten Energieversorgung durch die Zelle niedermolekulare Stoffe, Peptide und Proteine über Membranen transportieren können. Die ABCA1-Transporter-Inhibitoren Glyburid und Probenecid reduzieren den MIF-Export konzentrationsabhängig um 70-95 %, ohne die Ausschüttung des klassisch sezernierten proinflammatorischen Zytokins TNF-α zu beeinflussen. Inhibitoren, die auf andere Subfamilien der ABC-Transporter wirken, haben keinen Einfluss auf den MIF-Export, was auch hier auf einen MIF-spezifischen Mechanismus hinweist.

Mit der Identifikation niedermolekularer Substanzen, die den MIF-Export inhibieren, könnten alternative Sekretionswege als bedeutende Zielstrukturen für den Einsatz von Therapeutika dienen. Nocodazol, Glyburid und Probenecid könnten potenzielle Basisstrukturen für das rationale Design von small molecule drugs liefern. Über den identifizierten Mechanismus können zukünftig assoziierte Proteine dieses Transportweges als weitere mögliche MIF-basierte Pharma-targets identifiziert und charakterisiert werden.

Macrophage migration inhibitory factor (MIF) has recently been rediscovered as a hormone, proinflammatory cytokine and counterregulator of glucocorticoid action. MIF plays a pivotal role during septic shock, acute and chronic inflammatory diseases and during innate and acquired immunity. Although MIF lacks a classical leader sequence, it is specifically secreted from monocytes, macrophages, T lymphocytes, epithelial cells and certain endocrine cells. In the present studies, we aimed to examine the biochemical properties of MIF as a leaderless secretory protein, to reveal the subcellular localization of MIF in monocytes and to characterize the export of MIF via an alternative non-classical secretory pathway.

Upon stimulation with LPS, neither intracellular nor exported MIF from typical immune-regulated murine macrophages or human monocytes was found to contain N-linked glycosylation that could be removed by PNGase F. In addition, in vitro translation of MIF in the presence of microsomes produces no detectable post-translational modification. Thus, MIF appears to leave the cell via an alternative secretory pathway.

Export of de novo synthesized and preformed MIF follows similar kinetics. Upon stimulation with LPS, MIF was recovered from the medium as early as 2 hrs after stimulation and secretion sustained for 7-8 hrs. The amount of secreted MIF differs from large amounts for preformed MIF to a rather low rate for de novo synthesized MIF, suggesting that LPS stimulates MIF translation as well as involving a post-translational mechanism of stimulating MIF export.

In immune cells, MIF does not colocalize with marker proteins of the classical secretory pathway. Possible partial colocalisation was only observed with PDI, which could be due to the fact that the leaderless secretory protein PDI, besides its typical localisation in the ER, has been shown to be exported to the cell surface.

Inhibitors of the classical secretory pathway rather enhance than reduce MIF export from monocytes. Also, secretion of preformed MIF seems to be independent of a continuous cellular energy source. MIF secretion is insensitive to brefeldin A and Monensin and does appear to use recycling endosomes to exit the cell. However, as MIF export is enhanced by calciumionophor A23187, that stimulates exocytosis, and reduced by incubation at 18°C, an association of MIF with late secretory vesicles could be possible.

The export of MIF was reduced by nocodazole, an inhibitor of tubulin polymerization, over a wide concentration range, suggesting that this alternative mechanism of MIF release requires an intact tubulin network. As other tubulin network pertubing agents had no impact, nocodazole appears to act specifically on MIF release.

MIF export involves proteins of the ABC transporter superfamily. These proteins translocate a wide variety of substrates including sugars, amino acids, metal ions, peptides and proteins across extra- and intracellular membranes. Glyburide and probenecide, two inhibitors of ABCA1 transporters, reduce MIF export in a dose-dependent fashion between 70-95%, whereas TNF-α secretion is not reduced. Again, inhibitors of other ABC subfamilies do not reduce MIF export, indicating a distinct mechanism of alternative MIF release.

The identification of low molecular weight inhibitors of MIF export reveals alternative secretory pathways as valuable targets for the development of therapeutics. Nocodazol, glyburide and probenecide, as well as novel, yet unidentified proteins associated with this alternative pathway, could serve as lead structures in the development of small molecule drugs for an anti-MIF therapy.