Aspects of mitogen-activated protein kinase cascade activation by epidermal growth factor (EGF): kinetics and crosstalk mechanism with tumor necrosis factor alpha (TNFalpha)

Abstract

Using a mathematical/computational model developed on known components of epidermal growth factor (EGF) signaling pathway (Schoeberl, 2002), several aspects of the EGF signaling pathway could be evaluated and validated when compared to experimental data. The model provided insight into signaling response relationships between the ligand binding to the EGF receptor at the cell surface and the activation of downstream responses, for example, the phosphorylation of ERK-1/2 and expression of the target gene, c-fos. Concentration dependent-inhibition of MEK1 kinase reflected on inhibition of EGF-induced ERK-1/2 phosphorylation and the experimental data correlated well with mathematical model simulation. TNF was able to induce ERK-1/2 phosphorylation in a manner dependent on MEK-1 activation but, unlike EGF-mediated MAPK activation, it seemed independent of Ras, Raf or MEKK1. Despite ERK activation, induction of Elk-1 transcriptional activity and c-fos expression were not observed following TNF stimulation in contrast to EGF-treated cells. These data indicate, first, the existence of an alternative route to ERK phosphorylation by TNF other than the classical Ras-Raf pathway and, second, the existence of transcriptional response specificity which may depend on the amplitude and duration of ERK activation induced by diverse stimuli. Besides activating fairly known specific signaling transduction pathways which lead among others to NF-kB and JNK activation, TNF has been shown to be involved in crosstalk with other receptors, a phenomenon much less understood. In the work presented here the features of crosstalk mechanisms between EGF and TNF signaling pathways were investigated. Short time TNF pre-incubation (3 min) prior to EGF stimulation resulted in additive ERK-1/2 phosphorylation whereas 30 minutes pre-incubation induced decrease on EGF-mediated ERK-1/2 phosphorylation as well as on Raf-1 kinase activation of HeLa cells. However, no apparent differences were observed in the levels of EGF-induced EGFR phosphorylation. Moreover, confocal microscopy showed no physical interaction between the two receptors. Although ceramide formation has been regarded as an important mediator of some TNF-dependent responses, it seems not to play any role in the inhibitory effect in the EGF response of HeLa cells observed after 30 min TNF pre-treatment as no increase in cellular ceramide was detected during this time. In addition, inhibitors of the de novo pathway of ceramide formation did not revert TNF-mediated inhibition of EGF-induced Raf kinase activation and ERK-1/2 phosphorylation in HeLa cells. Taken together, these results suggest that TNF negatively regulates EGF-induced ERK-1/2 activation at the level of c-Raf kinase, in a manner independent of ceramide formation.

Diverse Aspekte des EGF-Signaltransduktionswegs konnten durch den Vergleich experimenteller Daten, die mit der humanen Karzinomzellinie HeLa gewonnen wurden, mit der Simulation eines mathematischen Computer-Modells, dessen Entwicklung auf bekannten Komponenten des EGF-Signaltransduktionswegs basiert ausgewertet und nachvollzogen werden. Dieses Modell ermöglicht einen Einblick in die Beziehungen innerhalb des Signaltransduktionswegs zwischen der Bindung des Liganden an den membranständigen EGF-Rezeptor und der Aktivierung von im Signalweg stromabwärts gelegenen Komponenten, z.B. der Phosphorylierung von ERK-1/2 und der Expression des Zielgens c-fos. Eine gute Korrelation zwischen den experimentellen biologischen Daten und der Simulation durch das mathematische Modell konnte bei der konzentrationsabhängigen Inhibition von MEK1 durch den Inhibitor (PD 98031) gezeigt werden. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, daß mathematische Modelle in Kombination mit experimenteller Datenanalyse hilfreiche Instrumente sein können, um neue Einblicke in die komplexen Mechanismen der intrazellulären Signalregulation zu ermöglichen. TNF ist ein potentes Zytokin, das von mehreren Zelltypen, unter ihnen Makrophagen, Monozyten und Fibroblasten, als Antwort auf Entzündung, Infektion und andere Umweltstimuli produziert wird. TNF ruft ein breites Spektrum an systemischen und zellulären Antworten hervor, wie z.B. Fieber, die Aktivierung und Migration von Lymphocyten und Leukocyten, Zellproliferation, -differenzierung und Apoptose. Als Antwort auf die Behandlung mit TNF werden in den meisten Zelltypen der Transkriptionsfaktor NF-kappaB und JNK aktiviert. Unter gewissen Umständen kann in Folge der Caspase-Kaskade Aktivierung auch Apoptose induziert werden. In dieser Arbeit konnte in HeLa-Zellen gezeigt werden, daß TNF, in einer MEK-1 aktivierungsabhängigen Weise, diPhosphorylierung von ERK-1/2 induzieren kann, diese jedoch anders als bei der EGF abhängigen MAPK Aktivierung, unabhängig von der Aktivität von Ras, Raf oder MEKK1 erscheint. Im Unterschied zu EGF behandelten Zellen, konnte nach einer TNF Stimulierung trotz ERK Aktivierung keine Induktion von Elk-1 Transkriptionsaktivität oder c-fos Expression beobachtet werden. Diese Daten weisen auf die Existenz eines alternativen Weges zum klassischen Ras-Raf Signalweg hin, die zur ERK Phosphorylierung durch TNF führt. Andere Arbeiten haben gezeigt, daß TNF ebenfalls in crosstalk-Mechanismen mit anderen Rezeptoren verwickelt ist, ein bisher noch wenig verstandenes Phänomen. In dieser Arbeit wurde der crosstalk-Mechanismus zwischen den Signalwegen von EGF und TNF untersucht. Eine kurze Vorinkubation (3 Minuten) mit TNF vor der EGF Stimulation führte zu einer additiven ERK-1/2 Phosphorylierung, während eine Vorinkubation mit TNF von 30 Minuten eine Verringerung der EGF-vermittelten ERK-1/2 Phosphorylierung sowie der Raf-1 Kinase Aktivierung ergab. Es konnte jedoch kein ersichtlicher Unterschied in der EGF-induzierten Phosphorylierung des EGF-Rezeptors beobachtet werden. Ebenfalls konnte mittels konfokaler Mikroskopie keine räumliche Nähe zwischen den beiden Rezeptoren gezeigt werden. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, daß TNF die EGF-induzierte MAP-Kinase Aktivierung auf c-Raf Ebene negativ reguliert. Obwohl die Bildung von Ceramid als wichtiger Botenstoff für einige TNF-vermittelte Antworten beschrieben ist, scheint Ceramid bei dem durch die TNF-Vorbehandlung erzielten inhibitorischen Effekt auf MAPKKK keine Rolle zu spielen, da kein Anstieg des zellulären Ceramidspiegels beobachtet wurde. Hinzu kommt, daß Inhibitoren des de novo Ceramid-Syntheseweges die TNF vermittelte Inhibition der EGF-induzierten Raf-Kinase Aktivierung und ERK-1/2 Phosphorylierung nicht aufheben konnten. Trotzdem kann bei diesem Effekt eine mögliche Rolle des endogenen basalen Ceramids nicht ausgeschlossen werden, da theoretisch die Möglichkeit besteht, daß endogenes Ceramid als Antwort auf eine TNF-Behandlung transloziert und auf diese Weise Signale aus spezifischen zellulären Kompartimenten zu andere Positionen innerhalb der Zelle gelangen könnten. Die Tatsache, daß TNF je nach Behandlungslänge einerseits die ERK-1/2 Phosphorylierung induzieren und anderseits die EGF-induzierte Raf-1 Kinase Aktivierung inhibieren kann, zeigt die duale Funktion dieses vielfältigen Moleküls. So kann erwartet werden, dass die zelluläre Antwort sowohl vom Zelltyp, als auch von der durch externe Stimuli beeinflußten Balance zwischen Zellzyklusarrest/Apoptosis und Überlebens-Signale/Zellproliferation abhängt.