Molekulare Mechanismen der Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-1 (TNF-R1)-vermittelten Apoptose

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Mechanismen von TNF-, TRAIL- und FasL-induzierten Signalwegen. Schwerpunkt war hier insbesondere die TNF-R1-vermittelte Apoptose und die Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK) durch die genannten Zytokine. Vor einiger Zeit wurde gezeigt, daß der Nicht-Todesrezeptor TNF-R2 in bestimmten Zelltypen Apoptose induzieren kann. Die Induktion der Apoptose durch diesen und einige andere TNF-Rezeptoren ohne Todesdomäne erfolgt über die Bildung von endogenem Membran-TNF. Dieses membranständige TNF aktiviert dann den Todesrezeptor TNF-R1. Interessanterweise ist auch der TNF-R1 selbst in der Lage, nach Stimulation endogenes TNF zu produzieren. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, daß Geldanamycin, ein Inhibitor des Hitzeschock Protein 90 (Hsp 90), sowie der Proteasomeninhibitor MG-132, die beide den NF-kB-Signalweg blockieren, zwar die schnelle TNF-R1-vermittelte, nicht aber die TRAIL-vermittelte Apoptose in Kym-1-Zellen inhibieren. Auf die späte TNF-R1-vermittelte Apoptose war der Einfluß der Inhibitoren sehr viel schwächer (GA) bzw. nicht mehr beobachtbar (MG-132). Dies ist ein Hinweis darauf, daß der NF-kB-Signalweg eine Rolle für die schnelle TNF-R1-vermittelte Apoptose-Induktion spielt. Eine Stimulation des TNF-R1 durch agonistische Antikörper führte zur Induktion von endogenem TNF und Apoptose. Der Einsatz TNF-spezifischer Antikörper verhinderte die schnelle Apoptose-Induktion. Die TNF-R1-stimulierten Kym-1-Zellen exprimierten TNF nach TNF-R1-Aktivierung hauptsächlich in einer Zell-assoziierten Form, was vermuten läßt, daß es sich bei dem endogen produzierten TNF um Membran-TNF (memTNF) handelt. Es ist anzunehmen, daß dieses membranständige TNF den TNF-R2 aktiviert, da Membran-TNF im Vergleich zu TNF-R1 ein guter Aktivator dieses Rezeptors ist. Nach simultaner Stimulation beider TNF-Rezeptoren durch agonistische Antikörper war Geldanamycin nicht mehr in der Lage die Induktion der Apoptose zu inhibieren. Dies deutet auf eine Kooperation beider TNF-Rezeptoren bei der schnellen TNF-R1-vermittelten Apoptose in Kym-1-Zellen hin. Die Induktion von membranständigem TNF und der folgende „Crosstalk“ zwischen TNF-R1 und TNF-R2 bewirken so diese schnelle und starke TNF-R1-vermittelte apoptotische Antwort. Durch diesen Rezeptor-„Crosstalk“ wird die TNF-R1-vermittelte Apoptose zudem unabhängig von permanenter exogener TNF-Stimulation. Untersuchungen der gegenseitigen Beeinflussung der TNF-R1-vermittelten JNK-Aktivierung und der TNF-R1-vermittelten Apoptose-Induktion ergaben, daß die TNF-R1-vermittelte JNK-Aktivierung nur eine untergeordnete Rolle für die TNF-R1-vermittelte Apoptose spielt. Es ergab sich weiter, daß zwei verschiedene Mechanismen für die TNF-R1-vermittelte JNK-Aktivierung existieren: ein transienter, Caspase-unabhängiger Mechanismus, der durch Vorstimulation mit NF-kB-induzierenden Liganden gehemmt werden kann und ein verzögert einsetzender Mechanismus, der Caspase-abhängig ist. Im Falle der TRAIL-induzierten JNK-Aktivierung zeigte sich gleichfalls die Existenz zweier verschiedener Zelltyp-abhängiger Signalwege, die JNK aktivieren. Ein Caspase-abhängiger, aber RIP-unabhängiger und ein RIP-abhängiger aber Caspase-unabhängiger Signalweg. Es muß sich jedoch in der Zukunft erst zeigen, ob die JNK-Aktivierung tatsächlich eine Folge der Apoptose ist, oder ob die beteiligten Caspasen über einen getrennten Apoptose-unabhängigen Signalweg aktiviert werden.

The members of the TNF ligand family are a group of cytokines involved in a variety of biological processes including inflammation, apoptosis, autoimmunity and oncogenesis. The TNF-ligands exert their functions through death domain-containing receptors and receptors which lack a death domain. Stimulation of death receptors typically leads to the recruitment of cytoplasmatic DD-containing adapter proteins that couple these death receptors to the apoptotic machinery of the cell. The receptors without a DD interact with members of the TNF-receptor associated factor-family leading to the activation of NF-kB, JNK and p38. This study investigates the molecular mechanisms of death receptor-induced signalling pathways, focussing in particular on TNF-R1-mediated apoptosis and activation of the c-Jun N-terminal kinase. It has been shown that selective stimulation of the non-DD-containing TNF-R2 is sufficient to induce apoptosis in Kym-1 cells by an indirect mechanism. Thus stimulation of TNF-R2 leads to the production of endogenous TNF which subsequently signals cell death via the DD-containing TNF-R1. Given that TNF-R1 is also capable to induce the production of endogenous TNF it was investigated whether this endogenous TNF is also involved in TNF-R1-induced apoptosis. Using the heat shock protein 90-inhibitor Geldanamycin as well as the proteasome inhibitor MG-132 which both block the activation of NF-kB, prevention of TNF-R1-mediated apoptosis, but not TRAIL-induced cell death, could be observed in short term assays. Interestingly, in long term assays TNF-R1-induced cell death was only slightly affected by GA. An influence of necrotic pathways could be excluded by the use of the caspase-inhibitor z-VAD-fmk. This implicated an important role of the NF-kB-activation for TNF-R1-mediated apoptosis. Stimulation of TNF-R1 induced production of endogenous TNF and apoptosis in Kym-1 cells. Neutralising TNF-specific antibodies completely blocked TNF-R1-induced cell death in short term assays. TNF-R1-stimulated cells expressed TNF mainly in a cell-associated form, suggesting that endogenously produced TNF acts in its membrane-bound form. Membrane-TNF can strongly trigger both TNF receptors while soluble TNF predominantly acts via TNF-R1. Therefore endogenous memTNF produced by exclusive stimulation of TNF-R1 can efficiently trigger TNF-R2. Simultaneous stimulation of both TNF receptors is sufficient to induce apoptosis in the presence of GA or neutralising TNF-specific antibodies. This argues for a co-operation of both TNF receptors in the induction of apoptosis by TNF-R1. In this manner, induction of memTNF and the following crosstalk between TNF-R1 and TNF-R2 leads to a strong and fast occurring apoptotic response. Furthermore, we show that Kym-1 cells only need a short TNF-puls to initiate the induction of the apoptotic pathway. For HeLa cells, however, which are not capable to produce endogenous TNF after stimulation of TNF-R1, a permanent presence of exogenous TNF is essential to induce apoptosis, although in both cell lines a TNF-puls is sufficient for the induction of the NF-kB-signalling pathway. These data indicate that the formation of the apoptosis-compentent TNF-R1 signalling complexes is a secondary event occuring with time after the predominant formation of non-apoptotic gene-inductive receptor signalling complexes. However, DISC formation at TNF-R1 can be enhanced in some cells by the demonstrated production of endogenous memTNF, thus also circumventing the need of prolonged presence of exogenous soluble TNF for the induction of TNF-R1-mediated apoptosis. Recent published data have suggested the existence of a possible crosstalk between apoptosis and the activation of JNK. Nevertheless, it is still not clear whether JNK activation is pro- or anti-apoptotic. In this study it could be shown that TNF-R1-mediated activation of the JNK has no significant role in TNF-R1-induced apoptosis. On the other hand, there is evidence for the involvement of caspases in the activation of JNK induced by TNF, TRAIL and FasL. In the case of TNF-R1-mediated JNK activation two different pathways could be observed: first, a transient, caspase-independent pathway, which could be inhibited by pre-stimulation of the cells with NF-kB-inducing cytokines. Second, a later occuring caspase-dependent JNK activation, which is paralleled by the initiation of the apoptotic program. Investigation of TRAIL- and FasL-induced JNK activation showed the existence of two celltype specific pathways – caspase-dependent, but RIP-independent and RIP-dependent, but caspase-independent. In conclusion, the involvement of caspases in the activation of JNK was demonstrated after stimulation with TNF as well as with TRAIL or FasL. But it remains to be verified, whether JNK activation is an apoptotic epiphenomen, as the caspases involved in JNK activation could also be activated by a distinct pathway independent of the induction of the apoptotic program.