Herstellung von 1,2-Dihydro-1,2-dihydroxybenzoat aus Toluol : Konstruktion von Stämmen für die selektive Hydroxylierung

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein biotechnisches Verfahren zur selektiven Hydroxylierung von Kohlenwasserstoffen zu entwickeln. Als Beispiel für einen derartigen Prozess sollte die Herstellung von Phenol aus Toluol ermöglicht werden. Für die Produktion von Phenol aus Toluol ist ein zweistufiges Verfahren notwendig: Die Biotransformation von Toluol zu Benzoatdihydrodiol (cis-Cyclohexa-3,5-dien-1,2-diol-1-carboxylat oder 1,2-Dihydro-1,2-dihydroxybenzoat) und die anschließende mit Säure katalysierte Umsetzung von Benzoatdihydrodiol zu Phenol. Für die Bereitstellung eines geeigneten Biokatalysators sollten in einen toluoltoleranten Stamm, der weder Toluol noch Benzoatdihydrodiol verwerten konnte, die erforderlichen Gene auf einem Transposon oder Plasmid integriert werden. Da zu Beginn dieser Arbeit kein geeigneter toluoltoleranter Bakterienstamm isoliert werden konnte, wurden die Gene für die Toluoloxidation in die Stämme R. eutropha B9 und P. putida U-JT103 übertragen. Von diesen Stämmen war bekannt, dass sie im Stoffwechsel von Benzoat auf der Stufe des Benzoatdihydrodiols bereits blockiert waren. Es konnte nachgewiesen werden, dass beide Stämme Toluol nicht oxidierten. Allerdings zeigten sie nur eine sehr geringe Toleranz gegenüber Toluol. Die zusätzlichen Gene für die Transformation von Toluol zu Benzoat wurden mit Hilfe des rekombinanten Plasmids pCK05 (Panke et al., 1998) übertragen. Dieses Plasmid trägt auf einem Transposon die erforderlichen Struktur- und Regulatorgene aus dem TOL-Plasmid pWW0 von P. putida mt-2. Mittels Konjugation konnte die Genkassette stabil in das bakterielle Chromosom von R. eutropha B9 und P. putida U-JT103 integriert werden. Transkonjuganten von P. putida U-JT103 oxidierten Toluol und Benzylalkohol zu Benzoatdihydrodiol. Dagegen setzten Transkonjuganten von R. eutropha B9 nur Benzylalkohol nicht aber Toluol zu Benzoatdihydrodiol um. Zusätzlich wurden die Gene für die Oxidation von Toluol zu Benzoat extrachromosomal auf einem Plasmid in die beiden Stämme eingebracht. Dazu wurde die Genkassette in "broad-host-range" Vektoren kloniert. Die konstruierten Plasmide pBBSG1 und pMMSG6 wurden ebenfalls mittels Konjugation in die Stämme R. eutropha B9 und P. putida U-JT103 übertragen. Transkonjuganten von R. eutropha B9 setzten wiederum nur Benzylalkohol nicht aber Toluol zu Benzoatdihydrodiol um. Transkonjuganten von P. putida U-JT103 oxidierten zwar Toluol zu Benzoatdihydrodiol, allerdings konnten im Vergleich zu den Transkonjuganten mit den zusätzlichen Genen im Chromosom keine besseren Umsatzraten erreicht werden. Die Expression der Gene wurde auch in E. coli DH5a untersucht. Hierfür mussten neben den Genen der Enzyme für die Oxidation von Toluol zu Benzoat auch die Gene für die Benzoat-Dioxygenase kloniert werden. In dieser Arbeit gelang es nicht, die Gene für die Enzyme des vollständigen Abbauweges auf einem Plasmid bereitzustellen. Die Gene für die Oxidation von Benzoat zu Benzoatdihydrodiol konnten aber separat auf einem weiteren Plasmid (pBBSG2) kloniert werden. Somit standen zwei verschiedene rekombinante E. coli DH5a-Stämme zur Verfügung: einer für die Transformation von Toluol zu Benzoat und ein weiterer für den Umsatz von Benzoat zu Benzoatdihydrodiol. Eine Mischkultur aus beiden rekombinanten Stämmen setzte Toluol zu Benzoatdihydrodiol um. Des weiteren war es gelungen, die beiden Plasmide zusammen in einen Stamm (ebenfalls E. coli DH5a) zu transformieren. Auch mit diesem Konstrukt konnte Toluol zu Benzoatdihydrodiol umgesetzt werden. Die geringe Toluoltoleranz von P. putida U-JT103 und E. coli DH5a während des Umsatzes von Toluol zu Benzoatdihydrodiol führte zu einer hohen Instabilität der konstruierten Stämme. Die Ausbeuten an Benzoatdihydrodiol lagen zwischen 70 und 99 %. P. putida U_TP10 (Transkonjugante mit der Genkassette im Chromosom) wurde für einen möglichen Einsatz als Biokatalysator in einem großtechnischen Prozess weiter untersucht. Mit den Ergebnissen konnte eine volumetrische Reaktorproduktivität von 0,02 mol×l-1×h-1 abgeschätzt werden. Aufgrund der geringen Produktivität und hohen Instabilität des Biokatalysators ist ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung des Massenprodukts Phenol gegenüber den etablierten chemischen Verfahren aus wirtschaftlicher Sicht nicht konkurrenzfähig. Allerdings können die konstruierten Stämme für die Produktion von chiralen Diolen eingesetzt werden, die chemisch nur mit unvergleichlich hohem Aufwand herzustellen sind.

The aim of the present work was to develop a biotechnical process for the selective hydroxylation of hydrocarbons. As an example for such a process the synthesis of phenol from toluene was chosen. For the production of phenol from toluene two steps are necessary: the bioconversion of toluene to benzoatedihydrodiol (cis-cyclohexa-3,5-diene-1,2-diol-1-carboxylate or 1,2-dihydro-cis-1,2-dihydroxybenzoate), which is further converted to phenol by an acid catalyzed process. For the bioconversion new toluene-tolerant bacteria have to be constructed, which are able to transform toluene to benzoatedihydrodiol. For this purpose the genes involved in the oxidation of toluene via benzoate had to be introduced into a toluene-tolerant strain, which could not degrade toluene or benzoatedihydrodiol. At the beginning of this work the isolation of an appropriate strain with sufficient tolerance toward toluene for the construction failed. Therefore R. eutropha B9 and P. putida U-JT103 were selected as hosts for the genes involved in the oxidation of toluene. These mutant strains already harbored the ability to convert benzoate to benzoatedihydrodiol. Both strains were not able to degrade toluene but their tolerance against toluene was very low. The additional genes for the conversion of toluene to benzoate were introduced using the transposon donor pCK05 (Panke et al., 1998). Transposon donor pCK05 carries the gene cassette encoding the complete upper operon of plasmid pWW0 of Pseudomonas putida mt-2 along with its native toluene-responsive regulator gene on the mini-Tn5 transposon. pCK05 was conjugated into R. eutropha B9 and P. putida U-JT103 in order to obtain stable strains that have the expression cassette integrated in the genome. Selected transconjugants of P. putida U-JT103 were able to transform toluene and benzylalcohol to benzoatedihydrodiol. Positive transconjugants of R. eutropha B9 could only convert benzylalcohol to benzoatedihydrodiol but not toluene. In addition the genes for the conversion of toluene to benzoate were introduced in both strains on a plasmid. Therefore the gene cassette was cloned into broad-host-range vectors. The constructed plasmids pBBSG1 and pMMSG6 were conjugated into R. eutropha B9 and P. putida U-JT103. Transconjugants of R. eutropha again were able to transform benzylalcohol to benzoatedihydrodiol but not toluene. Transconjugants of P. putida U-JT103 oxidized toluene to benzoatedihydrodiol, but compared to the transconjugants with the gene cassette introduced into the genome the rates of bioconversion were not improved efficiently. The expression of the genes cloned into the broad-host-range vectors was also tested in E. coli DH5a. In the case of E. coli the genes for the benzoate-dioxygenase had to be cloned in addition to the genes for the transformation of toluene to benzoate. In this work attempts in combining the genes for the whole necessary degradation pathway failed, but the genes for the benzoate-dioxygenase could be cloned separately on a second plasmid. Thus two different recombinants were available, one for the conversion of toluene to benzoate and the other for the conversion of benzoate to benzoatedihydrodiol. In a mixed culture formation of benzoate-dihydrodiol was accomplished. It was also possible to maintain the two plasmids together in the single host E. coli DH5a, which could also carried out the bioconversion. The weak solvent-tolerance of the recipient strains P. putida U-JT103 and E. coli DH5a leads to a high instability of the constructed biocatalysts during bioconversion of toluene. Yields obtained with the constructed strains were about 70 to 99 %. Properties of P. putida U_TP10 (transconjugant with the gene cassette integrated into the genome) were further investigated in regard to use this strain as biocatalyst in industrial process. With the results a volumetric reactor activity of about 0,02 mol×l-1×h-1 for an industrial process was estimated. Because of the very low activity and instability of the constructed biocatalysts a biotechnical process for the production of the bulk chemical phenol is economical not efficient compared with the common chemical processes of industry.