Elucidation of thiol-protein oxidoreductase activity of the cytokine macrophage migration inhibitory factor (MIF) by biochemical redox and site-specific mutagenesis analysis

Abstract

Der Makrophagen-migrationsinhibierende Faktor (MIF) ist ein proinflammatorisches Zytokin mit enzymatischer Aktivität. Obwohl eine Vielzahl biologischer Aktivitäten beschrieben wurden, ist der molekulare Mechanismus von MIF weitgehend unbekannt. Ziel dieser Arbeit war es, mögliche Zusammenhänge zwischen den biochemischen Redox-Eigenschaften von MIF und den biologischen Eigenschaften sowie der Signaltransduktion - MIF-abhängige Effekte von JAB1 und Regulation der Apoptose durch MIF - zu untersuchen. Zusammengefasst bestätigen meine Daten, dass MIF ein Redoxenzym ist, dessen Oxidoreduktase-Aktivität auf einem CXXC-Motiv als katalytischem Zentrum basiert. Ich konnte zeigen, dass die Inhibition der Apoptose, möglicherweise auch die Modulation anderer Signalwege durch MIF, mindestens teilweise im Zusammenhang mit der Redoxaktivität stehen. Durch die detaillierte Charakterisierung des Peptids MIF(50-65), konnte ich erste Beweise sammeln, dass MIF eine Rolle bei der Regulation des zellulären Redoxpools und möglicherweise auch bei der Bildung gemischter Disulfide mit Glutathion und Cystein spielt. Die beobachtete schnelle und transiente Cysteinylierung von MIF(50-65) könnte darauf hin weisen, dass Cysteinylierung eine Möglichkeit darstellt, die MIF-Aktivität zu modulieren. Darüber hinaus ist MIF(50-65) ein überraschend kleines Molekül, das wichtige MIF-Funktionen nachahmen kann. MIF(50-65) könnte daher als Templat für die Entwicklung neuartiger, MIF-basierter Peptid-Wirkstoffe dienen.

It was the aim of this work to investigate and establish potential connections between the biochemical redox properties of MIF and the role of the redox activity of MIF for its biological functions and effects on cellular signaling. In particular, I wished to determine in detail the biochemical redox properties of MIF such as its redox potential and to investigate potential links on MIF-dependent JAB1 effects and apoptosis-regulation through MIF. A quantification of the redox capacity of MIF therefore stood at the beginning of these investigations. When I began, a redox potential for MIF had not been determined, because no assay systems had been available to distinguish and separate the oxidized and reduced species of MIF. Together, my findings confirm the notion that MIF is a redox enzyme with an oxidoreductase-type of activity that is based on a CXXC motif as catalytic site. Through the detailed characterization of peptide MIF(50-65), I have obtained important first evidence as to the redox potential of MIF, which is likely to be relatively electronegative, and potential redox reactions that MIF may be involved in the cell such as regulation of the cellular redox pool and formation of possibly transient mixed disulfides with glutathione or cysteine. The observed fast and transient cysteinylation of MIF(50-65) could be an indication that cysteinylation may be a means of MIF modification to modulate its activity. Moreover, MIF(50-65) spanning the redox center of MIF has arisen as a surprisingly small molecule that can mimic important MIF functions. This thesis has therefore served to suggest that MIF(50-65) could be a template for the design of novel MIF-based peptide drugs. I showed that inhibition of apoptosis and possibly other cellular signaling pathways modulated by MIF are at least in part linked to the catalytic redox activity of MIF.