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Autor(en): Haug, Iris
Titel: Das Streptomyces coelicolor A3(2) Plasmid SCP2* : Ermittlung der vollständigen Sequenz und daraus abgeleitete Funktionen
Sonstige Titel: Streptomyces coelicolor A3(2) plasmid SCP2* : deductions from the complete sequence
Erscheinungsdatum: 2003
Dokumentart: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-14055
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/1616
http://dx.doi.org/10.18419/opus-1599
Zusammenfassung: SCP2 war das erste aus Streptomyces coelicolor A3(2) isolierte zirkuläre Plasmid, ein Fertilitätsfaktor ähnlich dem F-Plasmid aus Escherichia coli mit einer Kopienzahl von eins bis vier Plasmiden pro Chromosom. Das in dieser Arbeit untersuchte SCP2*-Plasmid ist ein spontan aufgetretenes Derivat von SCP2, welches sich durch erhöhte Fertilität und Mobilisierung chromosomaler DNA auszeichnet. Beide Plasmide sind seit langem Grundlage wichtiger Vektoren in der Streptomyceten-Genetik, die sich vor allem durch ihre Fähigkeit auszeichnen, große, insertierte Fragmente stabil weiterzugeben. Die Gesamtsequenz von SCP2* wurde ermittelt und ist in der GenBank unter der Nummer AL645771 hinterlegt. Teilsequenzen waren bereits vorher von anderen publiziert worden. Bei der Analyse der 31317 bp langen Sequenz von SCP2* wurden 34 offene Leserahmen identifiziert, deren abgeleitete Proteinsequenzen von 31 bis 710 Aminosäuren reichen. Den meisten dieser Proteine kann keine bekannte Funktion oder Verwandtschaft zu anderen Proteinen zugeordnet werden. Drei funktionelle Regionen waren bereits vorher identifiziert worden: die Stabilitäts-, die Transfer- und die Replikationsregion. Des Weiteren konnten zwei transponierbare Elemente identifiziert werden, IS1648 und Tn5417. Die Stabilitätsregion, welche zwischen den beiden transponierbaren Elementen positioniert ist, enthält zwei funktionelle Einheiten. Bei der ersten handelt es sich um das Protein MrpA (multimer resolution protein A), das ein neues Mitglied der l-Integrasen darstellt. Das Gen mrpA wurde in E. coli exprimiert und die Aktivität der Integrase untersucht. Die Erkennungssequenz mrpS der Integrase wurde über Mobility Shift-Experimente und durch Footprinting identifiziert. Sie besteht aus zwei 9 bp langen invers orientierten Sequenz-wiederholungen, die eine 18 bp große Kernregion flankieren. Zwei Integrase-Moleküle binden nicht-kooperativ in mrpS und induzieren dabei eine Beugung der DNA. Durch Expressionsstudien mit Hilfe einer Transkriptionsfusion mit xylE als Reportergen wurde eine Autoregulation durch MrpA nachgewiesen. In vivo Untersuchungen in E. coli zeigten die Fähigkeit von MrpA, in trans aus Plasmiden, die eine mrpS-Sequenz tragen, Multimere zu bilden und diese auch in Monomere aufzulösen. Liegen zwei mrpS-Sequenzen auf einem Plasmid vor, kommt es bei Zugabe von MrpA zur Deletion bzw. Inversion der DNA-Fragmente, die sich zwischen den cis-aktiven Erkennungssequenzen der Integrase befinden. Die zweite funktionelle Einheit der Stabilitätsregion bilden die Partitionsgene parA und parB, die zur Stabilität von SCP2* beitragen. Das Partitionssystem gehört zur Familie des Walker Ib-Typs. Das parA-Gen codiert eine ATPase. Das Gen wurde in E. coli exprimiert und die Magnesium-abhängige ATPase-Aktivität in Rohextrakt und gereinigtem Enzym untersucht. Das parB-Gen von SCP2* zeigt keine Verwandtschaft zu anderen parB-Genen und konnte in E. coli nur in sehr geringen Mengen exprimiert werden. Mit eGFP-Fusionen konnte die Verteilung von ParA und ParB in E. coli sichtbar gemacht werden. Expressionsstudien mit Hilfe von xylE-par-Fusionen in Streptomyces lividans deuten auf eine Regulation des par-Operons durch ParB hin. Der Beitrag, den die einzelnen Gene aus der Stabilitätsregion zur Stabilität des Plasmids SCP2* leisten, wurde untersucht, indem die Gene einzeln oder in Gruppen in Vektoren eingefügt wurden. Befinden sich alle drei Stabilitätsgene (mrpA, parA, parB) auf einem Plasmid, werden die Plasmide mit einer Wahrscheinlichkeit von 96 % in die Sporen segregiert. MrpA leistet dabei den wichtigsten Beitrag. Durch die Ermittlung der SCP2*-Sequenz konnten im Replikationsbereich von SCP2* zwei offene Leserahmen und eine nicht-codierende Region von 650 bp identifiziert werden, welche notwendig und ausreichend für die Replikation des Plasmids sind. Die entsprechenden Proteine RepI (161 Aminosäuren) und RepII (136 Aminosäuren) konnten in E. coli exprimiert werden. Die Interaktion von RepI mit dem nicht-codierenden DNA-Bereich aus der Replikationsregion von SCP2* wurde durch Mobility Shift-Experimente und Footprint-Untersuchungen gezeigt. Die Bindung erfolgt an drei Sequenzwiederholungen. Weiterhin können die Rep-Proteine in S. lividans ein Plasmid in trans komplementieren, welches nur den nicht-codierenden Bereich aus der Replikationsregion von SCP2* enthält und folglich alleine replikationsdefizient ist. Mit diesen Ergebnissen als Basis wurden verschiedene SCP2-Shuttle-Vektoren konstruiert, die in E. coli eine hohe Kopienzahl und in S. lividans wie auch das Ausgangsplasmid SCP2 eine niedrige Kopienzahl haben. Diese sollten besonders für die Klonierung großer Fragmente geeignet sein, unterscheiden sich aber durch die viel geringere Größe und damit bessere Handhabung von den bisher verwendeten SCP2-Vektoren.
The first circular plasmid isolated from streptomycetes was SCP2 from Streptomyces coelicolor A3(2). It is a conjugative low copy number plasmid present in one to four copies per chromosome. Later, the spontaneous derivative SCP2* was isolated which exhibits higher fertility and mobilisation of chromosomal DNA. Both plasmids are stably inherited, being retained by 99.5 % of spores after a single spore to spore cycle. For that reason the plasmids are frequently used as cloning vectors. As a first step in elucidating the biology of SCP2* the full sequence of plasmid SCP2* was determined in this work. The sequence was deposited at GenBank under the accession number AL645771. It should be noticed that parts of the sequence have been published before. A total of 34 open reading frames were identified in the 31317 bp sequence of SCP2* encoding putative proteins between 31 and 710 amino acids, most of them without known function. Three functional regions had been identified before, namely the stability region, the transfer and spreading region and the replicational region. Likewise two transposable elements, Tn5417 and IS1648, were found. The region necessary for stable inheritance of SCP2* comprises three genes resembling known plasmid stability functions. The first gene mrpA (multimere resolution protein A) encodes a new member of the l-integrase family of site specific recombinases of 371 amino acids. It was expressed in E. coli and the protein was purified. The recombination site mrpS recognized by MrpA was identified via mobility shift experiments and footprinting. The site is organized in two perfect inverted repeats of 9 bp flanking an 18 bp core region. Two molecules of MrpA are binding non-cooperatively to mrpS and induce a bend in the DNA. Examination with transcriptional fusions of mrpA and the reporter gene xylE indicated that MrpA is a transcription autoregulatory protein. In vivo experiments in E. coli with mrpS on plasmids and MrpA provided in trans revealed that MrpA is able to perform inter- and intramolecular recombinations, being able to resolve and build multimeric plasmids as well as to invert or delete DNA between mrpS sites depending on the orientation of the sites in the plasmids. The two other genes in the stability region were called parA and parB. ParA (310 aa) is an ATPase belonging to the Walker-type Ib. ParA was expressed in E. coli, purified and its ATPase activity established. The parB gene could only be expressed at a very low level in E. coli. By means of a translational fusions of parA and parB to eGFP, the distribution of the fusion proteins in E. coli were monitored. ParA-eGFP was homogeneously distributed over the whole cell whereas the ParB-eGFP was localised near the cell poles of the cells. The expression of both par-genes on SCP2* seems to be repressed by ParB as shown by transcriptional fusions of the par-operon with the xylE-reporter gene. To determine the contribution of the stability genes mrpA, parA and parB to the stabilisation of plasmids, the genes were inserted single or in groups into a SCP2* vector and the retention of the plasmids in spores after one or two cycles of growth without antibiotic selection was measured. Plasmid constructs containing all three stability genes were segregated in spores with a frequency of 96 %, with the highest impact coming from mrpA. The minimal replication region was confined to a 1.4 kb region, containing the genes repI and repII and an essential noncoding region of 650 bp. In S. lividans, the rep-genes were able to complement a plasmid containing only the noncoding region in trans. The deduced proteins of 161 aa (RepI) and 136 aa (RepII) shared significant similarity to each other but only in RepI a helix-turn-helix motif for DNA binding could be identified. Both genes were expressed in E. coli. The interaction of RepI with the noncoding replication region was demonstrated via mobility shift experiments and footprint assays. Three binding sites were identified. The knowledge gained on the stability and the replication of SCP2* during this work was used to develop a variety of shuttle vectors for streptomycetes. These vectors are much smaller in size compared to other SCP2 vectors used so far and should be useful for cloning large DNA fragments.
Enthalten in den Sammlungen:04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik

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