Verknüpfung molekularphysiologischer und reaktionskinetischer Werkzeuge zum Studium der in vivo Regulation des Glukosetransports von Saccharomyces cerevisiae

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde der Glukosetransport von Saccharomyces cerevsisiae auf reaktionskinetischer und molekularphysiologischer Ebene untersucht. Der Transport von Hexosen beruht bei S. cerevisiae auf dem Prozess der carriervermittelten erleichterten Diffusion. Durch die Expression geeigneter Transportproteine aus einem Set von 20 Genen kann sich die Zelle auf die Umgebungsbedingungen einstellen. Zunächst wurden die kinetischen Parameter für die Transportproteine Hxt1, Hxt5 und Hxt7 anhand von Einzelexpressionsmutanten in vivo geschätzt. Zusätzlich wurde der Wildtyp charakterisiert. Durch den Einsatz der aeroben fed-batch Kultivierung wurde der quasi-stationäre Zustand, der die Grundvoraussetzung für diese Untersuchungen ist, im Gegensatz zum steady-state bei Chemostat-Kultivierung nach kürzerer Zeit erreicht. Ausgehend von Zellpopulationen unter physiologisch definiertem Zustand wurden Glukosepulsversuche durchgeführt, und die Abnahme der extrazellulären Glukose verfolgt. Dieses Signal wurde mit dem Resultat einer numerischen Integration der dynamischen Bilanzgleichung verglichen, um unter Verwendung einer irreversiblen Michaelis-Menten Kinetik die kinetischen Parameter für die Einzelexpressionsmutanten und den Wildtyp abzuschätzen. Um den Transportschritt vollständig beschreiben zu können, ist es nötig, die Konzentrationen von intrazellulärer Glukose und Glukose-6-Phosphat (G6P) miteinzubeziehen. Es ist hierbei von Bedeutung, die initiale Aufnahmerate zu erfassen, da es während der Glukoseaufnahmemessungen zu einem Anstau intrazellulärer Glukose und infolgedessen einem Efflux derselben kommen kann. Dieser Efflux überlagert dann die Aufnahmemessungen. Während für die Messung von G6P geeignete Zellaufschluss und Extraktionsverfahren zur Verfügung standen, musste zur Erfassung des Signals intrazellulärer Glukose eine neue Methode entwickelt werden. Durch die Etablierung einer stopped-flow Probenahmetechnik wurde es möglich, die Dynamik der Konzentrationen intrazellulärer Glukose und von G6P im Millisekundenbereich zu erfassen. Die experimentellen Daten für die Dynamik von intrazellulärer Glukose und G6P können nun eingesetzt werden um ein Modell des Glukosetransports zu validieren, das auf einer reversiblen Influx-Efflux Kinetik basiert und eine Inhibition durch G6P berücksichtigt. In weiteren Untersuchungen wurde durch den Einsatz von Western blot Analysen die Dynamik der Hexosetransportproteine (Hxt1, Hxt5 und Hxt7) parallel als Antwort auf Veränderungen in der Glukosekonzentration verfolgt. Die gemessenen Konzentrationen für extrazelluläre Gukose, Ethanol und Biomasse wurden mittels Western blot Analyse mit der Expression der Transportproteine korreliert. Zuerst wurde eine glukoselimitierte Chemostat-Kultivierung auf einen batch-Prozess unter Glukoseüberschuss umgeschaltet. Dabei wurde eine Reprimierung des intermediäraffinen Hxt5-Proteins und eine Induktion von Hxt1, dem niedrigaffinen Transporter beobachtet. Die Expression des hochaffinen Hxt7-Transporters wird nach dem Umschalten zunächst verstärkt, um dann stark abzunehmen. Dies könnte einen Mechanismus der Zelle darstellen, auf die erhöhten Glukosekonzentrationen schnell zu reagieren. Beim zweiten Ansatz wurde eine Chemostat-Kultur durch multiple Glukosepulse dynamisch angeregt. Es konnte kein Einfluss der multiplen Stimuli auf die Expression der Transporter Hxt1 und Hxt5 nachgewiesen werden. Hxt7 hingegen zeigte deutliche Änderungen im Expressionsprofil. Es wurde eine Korrelation zwischen der Expression von Hxt7 und den spezifischen Raten für die Glukoseaufnahme und die Ethanolbildung beobachtet. Die Anwendung des Konzepts der "Metabolic control analysis" (Sensitivitätsanalyse) auf ein dynamisches Modell zur Beschreibung des anaeroben Wachstums von S. cerevisiae zeigte, dass die überwiegende Kontrolle des glycolytischen Flusses auf dem Transportschritt liegt. Somit sollte eine Erhöhung der Transportkapazität zu einem höheren glycolytischen Fluss führen. Unter Verwendung einer HXT5-Überexpressionsmutante (HXT5-Multicopyplasmid), der HXT5-Einzelexpressionsmutante sowie des Wildtyps wurden vergleichende Messungen des glycolytischen Flusses durchgeführt. Dazu wurden anaerobe Chemostat-Kulturen eingesetzt und die spezifischen Glukoseaufnahme- und Ethanolbildungsraten gemessen. Die Erhöhung der spezifischen Raten war unbefriedigend. Dies könnte an der durch die Überexpression verursachten "protein burden" liegen oder das Resultat von stark veränderten Poolkonzentrationen sein. Somit sollte ein zukünftiger Ansatz zur Steigerung der glycolytischen Leistung die Minimierung des "protein burden" sowie die Aufrechterhaltung der Homöostase berücksichtigen. Wie sich aus weiteren Simulationsergebnissen ergab, müssen dabei auch Enzyme berücksichtigt werden, die der Erhöhung der Poolkonzentrationen entgegenwirken.

The topic of the present work is the investigation of the glucose transport system of Saccharomyces cerevisiae at the level of reaction kinetics and molecular physiology. The transport of hexoses in S. cerevisiae is based on the mechanism of carrier mediated facilitated diffusion and consists of a multifactorial uptake system. The glucose-dependent modulation in the affinity of wild-type cells results from differential expression of 20 hexose transport-related proteins with significantly different affinities to the sugar. First the transcriptional regulation and the kinetic properties of the glucose transporters Hxt1, Hxt5, and Hxt7 were investigated using single expression strains. In addition the wild-type strain was characterized. Aerobic fed-batch cultures of these strains under quasi steady-state conditions were used for the estimation of kinetic properties of the individual transporters under in vivo conditions. Employing fed-batch cultivations instead of the routinely used chemostat cultivation a quasi steady-state can be reached more quickly than the steady-state of a chemostat. The quasi steady-state cultures were perturbated by a pulse of glucose and the dynamic responses of the strains to the changes in extracellular glucose concentration were investigated. For estimation of the kinetic parameters of each of the single expression strains and the wild-type strain the measured concentrations of extracellular glucose were compared with the result obtained from the numerical integration of the dynamic balance equation for extracellular glucose assuming irreversible Michaelis-Menten kinetics. For a complete description of the transport step it is necessary to include intracellular glucose and glucose-6-phosphate (G6P). To this end, it is important to measure the inital rate of transport because during uptake measurements intracellular glucose accumulates which in turn can lead to an efflux of glucose. This efflux of intracellular glucose superimposes the uptake measurements. Whilst for the measurements of G6P it was possible to resort upon existing methods for cell disruption and extraction, a new method had to be developed for the measurement of intracellular glucose. Establishment of a stopped-flow sampling system allowed measurements of metabolite dynamics on the time-scale of milliseconds. This system was applied to follow the dynamic signal of intracellular glucose and G6P. To elucidate the dynamics of expression of three characteristic glucose transport proteins in parallel in S. cerevisiae, their expression was followed after changes in the concentration of extracellular glucose. The concentrations of glucose, ethanol and biomass was correlated with the expression of the transporters measured via Western analysis. After a shift from glucose-limited continuous cultivation to batch-mode under glucose excess an induction of Hxt1 expression and a decrease in the expression of Hxt5 was observed. Expression of Hxt7 also declined after an initial increase in the abundance of this protein. This inital increase of the Hxt7 expression may reflect a cellular mechanism to ensure a rapid uptake of the additional available glucose. In a second approach multiple glucose pulses to a chemostat cultivation under glucose limitation were applied to simulate concentration gradients in large-scale production bioreactors. No changes were observed in the expression of Hxt1 and Hxt5 upon multiple stimuli. In contrast, expression of Hxt7 showed a clear response to the multiple pulses. A correlation between the expression of Hxt7 and the specific rates for uptake of glucose and the excretion of ethanol could be demonstrated. Metabolic control analysis of a dynamic model describing anaerobic growth of S. cerevisiae has shown that the overwhelming control of glycolytic flux resides with the sugar uptake step. It was thus concluded that an enhancement of the transport capacity should lead to an increased glycolytic flux. To test this hypothesis the glycolytic flux of a strain overexpressing HXT5 were compared with a HXT5 single expression strain, and a wild-type strain. To this end, the specific rates of glucose uptake and ethanol excretion of the different strains were measured in anaerobic chemostat cultures. The enhancement of the specific uptake and excretion rates by the overexpression strain was rather modest and not satisfying. This could be due to the "protein burden" resulting from overexpression or because of the great change in metabolite pool concentrations. Substantial changes in metabolite concentrations may be cytotoxic or lead to unwanted flux diversion. Therefore a future approach to enhance the glycolytic flux has to ensure a minimum of "protein burden" and the maintainance of homeostasis should also be considered. As further simulation results showed, also enzymes need to be considered which counteract the increasing pool concentrations.