Neuartige Poly(3-Hydroxybutyrat) Depolymerasen aus Paucimonas lemoignei und Rhodospirillum rubrum

Abstract

Aus Paucimonas lemoignei-Kulturüberstand wurde eine neuartige unter Kohlenstoffmangel während des späten exponentiellen Wachstums auf organischen Säuren oder parakristallinen dPHASCL {denaturierte Poly[(R)-3-Hydroxyalkanoate]; Monomeruntereinheiten C3-C5} gebildete PHASCL Depolymerase (PhaZ7; 36.2 kDa, stabil bis pH 12, 60°C) isoliert. Das Enzym hydrolysierte amorphe nPHASCL (zu 3-HA Pentamer) und ataktische P[(R,S)-3-HB]. PHAMCL (> C6), Polynukleotide, Proteasesubstrate, Poly(6-Hydroxyhexanoat), Lipide wurden nicht hydrolysiert. phaZ7 mit SacB-Signalsequenz wurde heterolog in Bacillus subtilis expremiert. Partielle Homologien zu Bacillus Lipasen und ortsgerichte Mutagenese präferieren S136, D242, H306 (H47G48 Oxyanion) als katalytische Triade. PhaZ7 entspricht dem „dPHB Depolymerase Inhibitor“ (MUKAI et al., 1992). Substratspezifität/kinetischen Studien wiesen auf eine Kooperativität der PHASCL Depolymerasen aus P. lemoignei hin. Intrazelluläre nPHASCL Depolymerase aus Rhodospirillum rubrum (PhaZ1Rr) wurde gereinigt und charakterisiert. Die nPHB-Hydrolyse in vitro erforderte zwei lösliche Komponenten: thermostabilen „Aktivator“ und thermolabile Depolymerase (MERRICK & DOUDOROFF, 1964). Vorinkubation von nPHB mit Aktivator oder Proteasen erhöhte die Hydrolyserate (> 6x). Der Aktivator war Protease-sensitiv, stabil in Alkanen, Ketonen, Alkoholen und schwach polaren Lösungsmitteln. PhaZ1Rr (35kDa, Topt.50°C, pHopt.9) hydrolysierte nPHB (3.1mmol cuts min-1 mg-1) unabhängig von Granula-Ursprung und Art der Aktivierung zu 3-HA-Mono-, Di- und Trimer, besaß jedoch keine Lipase-, Protease- oder Esteraseaktivität (lösliche Ester). phaZ1Rr wurde in E. coli heterolog expremiert. Die Aminosäuresequenz war homolog zu dPHASCL-Depolymerasen Typ 2. Linker- und Substratbindedomäne fehlten. Die Lipasebox (GIS19SG) entsprach PHAMCL Depolymerasen. Sequenzhomologien und Sekundärstrukturanalysen weisen auf S19, D115, H155 (H250G251 Oxyanion) als katalytische Triade hin.

First extracellular nPHASCL {amorphous poly[(R)-3-hydroxyalkanoic acid]} depolymerase (PhaZ7) was purified from Paucimonas lemoignei. The enzyme (36.2 kDa, stable < pH 12, 60°C) was secreted in late exponential growth phase as on paracrystalline dPHASCL in response to carbon starvation. It hydrolyzed nPHASCL releasing 3-HA pentamer. Shown on atactic poly[(R,S)-3-HB] PhaZ7 recognized the physical state of the polymer. PHAMCL, polynucleotides, protease substrates, poly(6-hydroxyhexanoate) and lipids were not hydrolyzed. phaZ7 with SacB signal sequence was functionally expressed in Bacillus subtilis. Only limited homologies to lipases (Bacillus) were found. Sequence homologies and mutagenesis suggest a catalytical triad of S136, D242, H306 (H47G48 oxyanion). PhaZ7 was „dPHB depolymerase inhibitor“ (MUKAI et al., 1992). Substrate specificity/kinetic studies suggest that seven PHASCL depolymerases by P. lemoignei could provide a cooperative effect. Intracellular nPHASCL depolymerase from Rhodospirillum rubrum (PhaZ1Rr) was purified and characterized. Two soluble components were necessary for hydrolysis of nPHB in vitro: thermostable „activator“ and heat sensitive depolymerase (MERRICK & DOUDOROFF, 1964). Hydrolytic activity increased (> 6x) after preincubation of nPHB with activator or proteases. The activator was protease sensitive stable in alkanes, ketones, alcohols, slightly polar solvent. PhaZ1Rr (35 kDa, Topt. 50°C, pHopt. 9) hydrolyzed nPHB (3.1 mmol cuts min-1 mg-1) to 3-HA-mono-, di- and trimer independent of PHB-source and activation type. Neither lipase protease nor significant esterase activity (soluble esters) was found. Structural gene was expressed in E. coli. Amino acid sequence revealed homologies to dPHASCL depolymerases (type 2) but linker or substrate binding domains were absent. Lipase box (GIS19SG) consists with PHAMCL depolymerase. Sequence homologies and secondary structure analysis suggest a catalytical triad: S19, D115, H155 (H250G251 oxyanion).