Enzymes and metabolites in picric acid (2,4,6-trinitrophenol) and 2,4-dinitrophenol biodegradation

Abstract

The bacterial strains Rhodococcus (opacus) erythropolis HL PM-1 and Nocardioides simplex FJ2-1A can use picric acid (TNP) and 2,4-dinitrophenol (DNP) as sole nitrogen source. Enzymes were identified which are isofunctional in both strains, using the same degradation mechanism. During the initial steps hydride ions were transferred to the aromatic ring of the electron deficient p-system, forming first the hydride s-complex of TNP, H--TNP, and subsequently the dihydride s-complex, 2H--TNP. The reactions were catalyzed by hydride transferase II (HTII) and hydride transferase I (HTI), respectively, together with the NADPH-dependent F420 reductase (NDFR) and the coenzymes NADPH and F420. NDFR, HTII, and HTI were cloned and purified as His-tag fusion proteins by Ni-NTA affinity chromatography. Reactions were followed by repeated recording of UV-visible spectra, and intermediates were identified by HPLC, HPLC-MS, and NMR measurements. H--TNP and 2H--TNP were chemically synthesized and used as standards and substrates. In the next step, a nitrite-eliminating enzyme releasing nitrite from 2H--TNP and generating the hydride s-complex of DNP (H--DNP) was identified. A tautomerase was shown to give rise to two tautomeric forms, the aci-nitro form and the nitro form of 2H--TNP, identified by HPLC and NMR measurements. Since the nitrite-eliminating enzyme used only the aci-nitro form as a substrate, it appears that the 2H--TNP tautomerase inhibits accumulation of the nitro form. Whereas the 2H--TNP tautomerase was cloned and purified as a His-tag fusion protein, the nitrite-eliminating enzyme was isolated by FPLC and the N-terminal sequence was determined. Databank search exhibited no similarities to any known proteins. HTI and NDFR, together with the coenzymes NADPH and F420, hydrogenated chemically synthesized H--DNP to 2H--DNP. It was shown by HPLC-MS that 2,4-dinitrocyclohexanone (2,4-DNCH) was generated after protonation. A hydrolase was purified by FPLC, catalyzing hydrolytic ring fission of 2,4-DNCH, forming 4,6-dinitrohexanoate (4,6-DNH). 4,6-DNH was identified by HPLC-MS. MALDI-TOF measurements showed that the 2,4-DNCH hydrolase consists of four identical subunits. Since determination of the N-terminal amino acid sequence exhibited that the corresponding gene was located on the known gene clusters of both strains, the gene function was recognized. Activity for the conversion of 4,6-DNH in crude extracts identified 4,6-DNH as a true intermediate of the degradation pathway of TNP and DNP.

Die Bakterienstämme Rhodococcus (opacus) erythropolis HL PM-1 und Nocardioides simplex FJ2-1A können Pikrinsäure (TNP) und 2,4-Dinitrophenol (DNP) als alleinige Stickstoffquelle nutzen. Dabei wurden Enzyme eines konvergenten Abbauwegs nachgewiesen, die in beiden Stämmen isofunktionell sind. Während der Initialschritte wird Hydrid auf den aromatischen Ring des elektronenarmen p-Systems übertragen, wobei sich zeigte, dass zuerst der Hydrid-s-Komplex von TNP, H--TNP, und in einer nachfolgenden Hydridübertragung der Dihydrid-s-Komplex, 2H--TNP, entsteht. Die Reaktionen werden von zwei Hydridtransferasen, HTII und HTI, katalysiert, wobei die NADPH-abhängige F420-Reduktase (NDFR) und die Coenzyme NADPH und F420 für den Umsatz notwendig sind. NDFR, HTII und HTI wurden kloniert und als His-tag-Proteine mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt. Die Reaktionen wurden mit Hilfe von UV/Vis-Spektren in zeitlichen Abständen von jeweils einer Minute verfolgt und die Metabolite mit HPLC-MS und NMR-Messungen nachgewiesen. H--TNP und 2H--TNP wurden chemisch synthetisiert, um sie sowohl als Standard sowie als Substrat einsetzen zu können. Im folgenden Abbauschritt wird durch ein Nitrit-eliminierendes Enzym eine Nitro-Gruppe aus 2H--TNP in Form von Nitrit abgespaltet, wobei der Hydrid-s-Komplex von DNP (H--DNP) entsteht. Eine Tautomerase isomerisiert 2H--TNP zu zwei Tautomeren, die Aci-nitro- und die Nitro-Form. Dies wurde durch HPLC-MS und NMR-Messungen bestätigt. Da das Nitrit-eliminierende Enzym nur die Aci-nitro-Form umsetzen kann, verhindert die 2H--TNP-Tautomerase, dass die Nitro-Form als nicht weiter abzubauendes Produkt akkumuliert. Während die 2H--TNP-Tautomerase kloniert und als His-tag-Protein gereinigt wurde, konnte das Nitrit-eliminierende Enzym mittels FPLC isoliert, und die N-terminale Aminosäuresequenz bestimmt werden. Datenbank-Recherchen ergaben keine Ähnlichkeiten zu bekannten Enzymen. Die HTI und NDFR, zusammen mit den Coenzymen NADPH und F420, hydrierten chemisch synthetisiertes H--DNP zu 2H--DNP. Es zeigte sich, dass anschließend durch Protonierung spontan 2,4-Dinitrocyclohexanon (2,4-DNCH) entstand, was durch HPLC-MS-Messungen gezeigt wurde. Mittels FPLC wurde eine Hydrolase gereinigt, die eine hydrolytische Ringöffnung von 2,4-DNCH katalysierte, was zu 4,6-Dinitrohexanoat (4,6-DNH) als Produkt führte. 4,6-DNH konnte mit Hilfe von HPLC-MS-Messungen nachgewiesen werden. MALDI-TOF-Messungen ergaben, dass die 2,4-DNCH-Tautomerase wahrscheinlich als Tetramer mit vier identischen Untereinheiten vorliegt. Da die Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz der 2,4-DNCH-Hydrolase zeigte, dass das entsprechende Gen auf dem jeweils bekannten Gen-Cluster in beiden Stämmen zu finden war, konnte diesem Gen erstmalig eine Funktion nachgewiesen werden. Umsatzaktivitäten für 4,6-DNH mit Rohextrakt identifizierten 4,6-DNH als echtes Intermediat im Abbauweg von TNP und DNP.