Characterisation of TNF receptor-2 mediated signal initiation and transduction

Abstract

In this work, silica based micro-particles covalently coated with TNF were generated as a new tool to convert soluble into an equivalent of membrane bound TNF. This tool was employed to investigate the molecular events leading to TNFR2 mediated NFkappaB-signalling.

For the covalent coupling of TNF to silica beads, a TNF-mutant with a Cysteine and a Histidine tag (CysHisTNF) fused to its N-terminus was used. The particles were activated with sulfoSMCC, allowing the formation of a covalent C-S-thioether between the maleimide group of sulfoSMCC and the SH-group of the free Cysteine being presented by wild type CysHisTNF. Immortalised mouse fibroblasts lacking wild type TNFR1 and TNFR2 but stably over-expressing a TNFR2/Fas receptor-chimera (composed of the extracellular and membrane spanning domains of TNFR2 and the cytosolic domain of Fas/CD95) were employed as a test system to confirm the membrane bound TNF (memTNF)-like activity of TNF-labelled beads. These cells undergo apoptosis within an hour after stimulation with memTNF but are completely resistant to activation with soluble TNF (sTNF). CysHisTNF coated beads were shown to provide a memTNF-like derivative which was able to fully stimulate wild type TNFR2 or the TNFR2/Fas chimera. To allow TNFR1 or TNFR2 selective stimulation in the presence of both receptors, CysHisTNF-mutants binding selectively to one or the other TNF-receptor were employed. Control experiments with wildtype TNF revealed that a significant amount of the cytokine can bind to the beads by adsorption. Particles labelled with CysHisTNF, however, showed a higher bioactivity as compared to beads which had been treated with wildtype soluble TNF only. Investigations using confocal microscopy revealed that an average 6 TNF-coated beads of 1 µm diameter or one respective particle of 10 µm diameter were sufficient to trigger apoptosis in a single TNFR2-Fas expressing mouse fibroblast. This revealed an about 20 fold higher bioactivity as compared to the best so far available memTNF mimicking agent that was generated by sTNF (derivatives) stabilised at the receptor with 80M2, a non-agonistic TNFR2-specific monoclonal mouse antibody. TNFR1/Fas and TNFR2/Fas receptor-chimera were used to distinguish between the receptor-specific activity of sTNF or memTNF-equivalents on TNFR1 or TNFR2. Both receptor-chimera were demonstrated to activate the Fas-signal transduction pathway upon stimulation with memTNF-analoga by recruitment of FADD and/or Caspase-8 to the cytosolic portion of the receptor constructs, observed by confocal microscopy. However, only TNFR1/Fas could be stimulated with soluble TNF whereas TNFR2/Fas was fully resistant to sTNF action. Similar data were obtained after stimulation of wild type TNFR2 with a TNFR2-selective TNF-mutein being stabilised to the receptor with 80M2 or with a wtCysHisTNF-coated bead. Whereas these memTNF derivatives lead to the recruitment of TRAF2 to the TRAF-binding domain of the receptor, sTNF triggered no TRAF2-recruitment (Krippner-Heidenreich et al., 2002). In a HeLa cell overexpressing a full length wild type TNFR2-GFP construct, which was locally stimulated with a wtCysHisTNF-coated bead of 10 µm diameter, clustering of TNFR2-molecules to the bead-cell contact site as well as lateral diffusion of molecules from the direct vicinity to the bead could be observed by confocal microscopy. However, no indication of a lateral signal progression that would have generated the activation of non-stimulated receptor molecules was found. Selective activation of TNFR2-molecules led to their internalisation via a dynamin-1-dependent mechanism. Internalised TNFR2 was found partially associated with caveolae and in late endosomes. Internalisation of TNF-coated beads of 1 µm diameter could be shown to occur independently of interaction of the beads with TNFR2 and was not inhibited by a dominant negative dynamin-1 mutant, suggesting a mechanism of internalisation different of that operative for TNFR2. A TNFR2-receptor-construct devoid of its cytosolic domain, which was replaced by GFP, served to reveal that internalisation but not the clustering of TNFR2 is dependent of its cytosolic domain. TNFR2 mediated NFkappaB-translocation, activated by the stimulation of TNFR2 with memTNF-analogues, was shown to occur within 30 minutes. Of the three investigated NFkappaB-molecules p65, p50 and c-Rel, p65 was found to be the NFkappaB-protein mainly being translocated into the nucleus after stimulation of both TNFR1 as well as TNFR2. IKKgamma/NEMO could be demonstrated to be as essential for the release of NFkappaB from IkappaBalpha via TNFR2-signalling as is known for TNFR1. RIP, however, played no detectable role in TNFR2-mediated NFkappaB-translocation. Finally, TNFR2-mediated recruitment of TRAF2 was demonstrated to occur independently of TNFR2-internalisation.

TNFR1 kann sowohl lösliches als auch membrangebundenes TNF binden, zur Weiterleitung von Signalen. Im Gegensatz dazu kann TNFR2 zwar beide TNF-Formen binden, aber nur die Interaktion mit Membran-TNF führt zur vollständigen Aktivierung der TNFR2-vermittelten Signaltransduktion. Um die molekularen Ereignisse, die durch die Stimulation des TNFR2 mit Membran-TNF verursacht werden, angemessen zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit TNF-gekoppelte Mikropartikel auf Silica-Basis eingesetzt, welche die besondere Bioaktivität von Membran-TNF besitzen. In einem Test-System aus immortalisierten Mausfibroblasten, die weder TNFR1 noch TNFR2 exprimieren, dafür jedoch mit einer TNFR2/Fas-Rezeptorchimäre (bestehend aus dem extrazellulären und dem membrandurchspannenen Teil des TNFR2 und der zytosolischen Domäne des Fas-Rezeptors) stabil transfiziert waren, wurde die Membran-TNF-Aktivität der TNF-präsentierenden Partikel untersucht. TNFR2/Fas exprimierende Mausfibroblasten können nicht durch lösliches TNF in Apoptose gebracht werden, Membran-TNF dagegen induziert Apoptose innerhalb einer Stunde nach Stimulation der Zellen. Sowohl die TNFR2/Fas-Chimäre als auch wildtyp-TNFR2 wurden durch das auf Partikeln gebundene TNF angeregt, d.h. partikulär immobilisiertes TNF wirkt als memTNF. In weiteren Versuchen wurden für die selektive Stimulation des TNFR1 bzw. des TNFR2 TNF-Muteine verwendet, die selektiv nur an jeweils einen oder den anderen Rezeptor binden. Untersuchungen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie zeigten, dass 6 wtCysHisTNF-Partikel von 1 µm Größe oder ein einziges entsprechendes Partikel von 10 µm Größe ausreichten, um Apoptose in einem TNFR2/Fas-Mausfibroblasten auszulösen. Daraus errechnet sich eine etwa 20-fach höhere Bioaktivität im Vergleich zu dem bisher verwendeten memTNF-Analog, das aus TNF(-Muteinen) besteht, welches mit Hilfe des nicht agonistischen TNFR2-spezifischen Antikörpers 80M2 am TNFR2 stabilisiert wird. Für die Untersuchung der Rezeptor-spezifischen Wirkung von löslichem TNF bzw. der memTNF-Analoga wurden TNFR1/Fas und TNFR2/Fas Rezeptor-Chimären eingesetzt. Beide induzieren die Signalweiterleitung durch ihre zytosolische Fas-Domäne, die im Konfokalmikroskop auch durch die Rekrutierung von FADD und/oder Caspase-8 an die jeweilige Rezeptor-Chimäre beobachtet werden konnte. TNFR1/Fas konnte mit beiden TNF-Formen, der löslichen und der memTNF imitierenden, aktiviert werden, während TNFR2/Fas vollkommen resistent gegen eine Stimulation mit löslichem TNF war. Entsprechende Daten konnten an wildtyp-TNFR2-Molekülen reproduziert werden. Erst die Stabilisierung von TNF am Rezeptor mit Hilfe des nicht-agonistischen Antikörpers 80M2 oder der Kontakt mit TNF-gekoppelten Partikeln führte zur Rekrutierung von TRAF2 an den Rezeptor, wogegen lösliches TNF keine Reaktion auslöste (Krippner-Heidenreich et al., 2002). Ein einziges 10 µm großes, mit wtCysHisTNF überzogenes Partikel wurde eingesetzt, um eine HeLa-Zelle, die ein TNFR2-GFP Konstrukt überexprimierte, lokal zu stimulieren. Mit Hilfe eines Konfokalmikroskops konnte die Akkumulierung von Rezeptormolekülen an der Kontaktstelle zwischen Partikel und Zelle sowie die Diffusion links und rechts direkt benachbarter Molekülen in die Kontaktstelle beobachtet werden.

Die Internalisierung von TNFR2-Molekülen und ihre Lokalisierung in Lysosomen wurde ebenso gezeigt wie ihre Abhängigkeit von Dynamin. WtCysHisTNF-überzogene Partikel von 1 µm Durchmesser wurden ebenfalls internalisiert und in Lysosomen lokalisiert. Dieser Vorgang war unabhängig von der Interaktion der TNF-Partikel mit TNFR2 und von Dynamin. Dies weist auf eine Internalisierung durch einen Mechanismus hin, der sich von dem für die TNFR2-Internalisierung wirksamen unterscheidet. Mit Hilfe eines TNFR2-Konstrukts, dessen zytosolische Domäne durch ein GFP-Molekül ersetzt wurde, wurde gezeigt, dass die Akkumulation des TNFR2 in Clustern im Gegensatz zur Internalisierung des Rezeptors unabhängig von der zytosolischen Domäne erfolgte.

Die TNFR2-vermittelte NFkappaB-Translokation in den Zellkern, wie sie nach der Stimulierung des TNFR2 mit Membran-TNF-Äquivalenten erfolgt, war 30 Minuten nach der Aktivierung am stärksten. Von drei untersuchten NFkappaB-Proteinen p65, p50 und c-Rel, machte p65 den Hauptanteil des translozierten NFkappaBs aus, sowohl in der TNFR1- als auch in der TNFR2-vermittelten Signalübertragung. IKKgamma/NEMO, die regulatorische Untereinheit des IKK-Komlexes, wurde für die Phosphorylierung des Inhibitors von kappaB (IkappaB) und die Freisetzung von NFkappaB durch TNFR2 als ebenso essentiell befunden wie bereits für TNFR1 gezeigt wurde. Dagegen konnte keine Beteiligung von RIP während der TNFR2-vermittelten NFkappaB-Translokation festgestellt werden. Beobachtungen von TRAF2-Rekrutierung an den TNFR2 in Zellen, die eine dominant-negative Dynamin-1-Mutante exprimierten lieferten Hinweise, dass der TNFR2-vermittelte NFkappaB-Signalweg unabhängig von der Internalisierung des Rezeptors erfolgt.