Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.18419/opus-1661
Authors: Assohou-Luty, Constance
Title: Generation and characterization of CD40-Flag-FasL : a novel Fas agonist devoid of systemic toxicity
Other Titles: Herstellung und Charakterisierung von CD40-Flag-FasL, ein neuer Fas Agonist der keine systemische Toxizität zeigt
Issue Date: 2005
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-22703
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/1678
http://dx.doi.org/10.18419/opus-1661
Abstract: Soluble single chain antibody fusion proteins incorporating the extracellular domains of human TNF, FasL or TRAIL acquire functional properties similar to those of their corresponding membrane-bound forms, following interaction with surface antigens expressed by target cells. In this work, this principle is extended to include other selective protein-protein interactions. Soluble fusion proteins comprising, at the N-terminus, the extracellular domains of human CD40, 4-1BB, TNFR1, TNFR2, RANK and, at the C-terminus, the extracellular domain of human FasL were generated. CD40 was also fused to the extracellular domain of human TRAIL. In all cases the two domains were separated by the Flag sequence to facilitate the detection and purification of the fusion proteins, and all the DNA constructs had a leader sequence to target the resulting proteins to the secretory pathway. The proteins had MWs over the expected sizes, a tendency that was particularly striking for RANKed-Flag-FasL and CD40-Flag-FasL, probably due to post-translational modifications such as glycosylation. The proteins were subsequently analysed for their soluble FasL-like activity on HT1080 cells. Despite only moderate expression or barely detectable expression in the cases of TNFR1-Flag-FasL, 4-1BB-Flag-FasL and TNFR2-Flag-FasL, these proteins showed high specific activities. In sharp contrast to the above mentioned fusion proteins, supernatants of CD40-Flag-FasL and RANKed-Flag-FasL, which contained much more protein, showed very low and low specific activity, respectively. Since the activity of soluble FasL can be increased through multimerization (Schneider et al, 1998), the proteins were cross-linked via their internal Flag-tag. Surprisingly, it led to a decrease in activities for TNFR1-Flag-FasL, TNFR2-Flag-FasL and 4-1BB-Flag-FasL. The activity of RANKed-Flag-FasL could be increased by a factor of 50-100 but the cell death-inducing capacity of CD40-Flag-FasL was virtually unchanged by artificial cross-linking. The high specific activity observed for TNFR1-Flag-FasL, 4-1BB-Flag-FasL and TNFR2-Flag-FasL was thus likely the result of the presence of significant amounts of higher MW aggregates of homotrimers in the supernatants. RANKed-Flag-FasL was probably mostly non-aggregated and was therefore activated upon cross-linking. The lack of any M2 cross-linking antibody-mediated effect in the case of CD40-Flag-FasL does not indicate a defect in the FasL part of the protein but might rather reflect, for example, steric hindrance of the M2 antibody. RANKed-Flag-FasL and CD40-Flag-FasL were thus subsequently further analysed with respect to their capacity for target-dependent activation. CD40-Flag-FasL was stably expressed in HEK293 cells and then affinity purified from supernatants of the stable cells. Western blotting analysis showed that CD40-Flag-FasL migrated with a MW of ~50 kDa under reducing conditions however, analysis of the native protein by gel filtration showed that CD40-Flag-FasL eluted with an apparent MW of 471 kDa, corresponding to a 9.4 mer but this is likely to be an overestimation as CD40-Flag-FasL behaved like a homotrimeric molecule. Binding experiments showed that CD40-Flag-FasL could be immobilized specifically by CD40L-expressing cells and, furthermore, that upon binding it induced clustering of Fas on neighboring cells. CD40-Flag-FasL induced apoptosis and NFkappaB activation in a concentration-dependent manner in transfected HT1080 and KB cells expressing CD40L and not in parental cells, despite similar sensitivities of both parental and transfectant cells to cross-linked FasL. When RANKed-Flag-FasL was analysed in a setting allowing target antigen-mediated immobilization, the protein led to gene induction in a RANKL-dependent manner. The EC50 of CD40-Flag-FasL was shown to be ~ 4 logs lower in HT1080-CD40L compared to HT1080 cells. Cell death induced in CD40L-positive cells was accompanied by cleavage of pro-caspase-8 and activation of caspase-3 and could be completely inhibited by zVAD, Fas-Comp or an anti-human CD40L antibody. CD40-Flag-FasL induced apoptosis in a paracrine manner on by-stander cells and proved to be safe when assayed in vivo in mice for acute toxicity, whereas artificial cross-linking of CD40-Flag-FasL induced liver failure in a concentration-dependent fashion. The promising results obtained with CD40-Flag-FasL led to the cloning of a CD40-Flag-TRAIL construct that was shown to be capable of inducing both apoptosis and NFkappaB in a CD40L-dependent manner. CD40-Flag-TRAIL-mediated apoptosis was shown to be TRAIL-specific, to result from the interaction between CD40/CD40L, and to occur via interaction with TRAIL-R2 in both KB-CD40L and HT1080-CD40L cells. These promising results provide the basis for relatively simple development of safer i.e. less toxic FasL or TRAIL derivatives for the treatment of a variety of human pathologies.
Lösliche single chain Antikörper-Fusionsproteine, die Teile der extrazellulären Domäne aus TNF, FasL oder TRAIL enthalten, tragen funktionelle Eigenschaften ähnlich der entsprechenden membrangebundenen Form nach Interaktion mit der Antigen-exprimierenden Oberfläche der Zielzelle. In dieser Arbeit wurde dieses Prinzip auf andere selektiv ausgewählte Protein-Protein Interaktionen ausgeweitet. Es wurden mehrere lösliche Fusionsproteine, die die N-terminale extrazelluläre Domäne von humanem CD40, 4-1BB, TNFR1, TNFR2, RANK und die C-terminale extrazelluläre Domäne von humanem FasL umfassen, hergestellt. Außerdem wurde CD40 an die extrazelluläre Domäne von humanem TRAIL fusioniert. Das Molekulargewicht der Fusionsproteine wie es sich im Western Blot darstellte war etwas höher als das errechnete. Dies war besonders deutlich für RANKed-Flag-FasL und CD40-Flag-FasL und ist wahrscheinlich auf post-translationale Modifikationen wie Glykosylierungen zurückzuführen. Die Proteine wurden auf ihre lösliche FasL-ähnliche Aktivität auf HT1080 Zellen analysiert. Trotz einer nur mittleren bzw. einer kaum detektierbaren Expression von TNFR1-Flag-FasL, 4-1BB-Flag-FasL und TNFR2-Flag-FasL wiesen diese Protein eine hohe spezifische Aktivität auf. Überstände von CD40-Flag-FasL bzw. RANKed-Flag-FasL, die beide höhere Expressionen aufwiesen, zeigten lediglich eine sehr niedrige bzw. schwache spezifische Aktivität. Da die Aktivität von löslichem FasL durch Multimerisierung erhöht werden kann, wurden die Proteine über den internen Flag tag vorvernetzt. Dies führte zu einer Abnahme der Aktivität bei TNFR1-Flag-FasL, TNFR2-Flag-FasL und 4-1BB-Flag-FasL Die Aktivität von RANKed-Flag-FasL hingegen konnte um das 50-100fache erhöht werden, während die Zelltod-induzierende Wirkung von CD40-Flag-FasL durch die Vorvernetzung nahezu unbeeinflusst blieb Die hohe spezifische Aktivität, die für TNFR1-Flag-FasL, 4-1BB-Flag-FasL and TNFR2-Flag-FasL beobachtet werden konnte, resultiert wahrscheinlich aus der Präsenz von signifikanten Mengen an hochmolekularen Aggregaten der Homotrimere in den Zellkulturüberständen. RANked-Flag-FasL liegt wahrscheinlich in einem nicht aggregiertem Zustand vor, und konnte daher durch Vorvernetzung aktiviert werden. Die Beobachtung, daß bei CD40-Flag-FasL kein Antikörpervermittelter Effekt durch Vorvernetzung mit M2 erzielt werden konnte, muss nicht für einen Defekt im FasL-Teil des Fusionsproteins sprechen, sondern könnte viel eher, z.B. eine sterische Hinderung des M2 Antikörpers reflektieren. RANKed-Flag-FasL und CD40-Flag-FasL wurden daher weiter auf ihre Kapazität hin zur Zielstruktur-abhängigen Aktivierung untersucht. CD40-Flag-FasL wurde stabil exprimiert und aus dem Überstand der Zellen aufgereinigt. Western Blot Analysen zeigten, dass CD40-Flag-FasL unter reduzierenden Bedingungen bei einem Molekulargewicht von ~50 kDa migriert. Untersuchungen am nativen Protein mittels Gelfiltration zeigten, dass CD40-Flag-FasL bei einem wahrscheinlichen MW von 471 kDa eluiert. Dies würde einem 9,4mer bzw. drei Homotrimeren entsprechen, was wahrscheinlich jedoch eine Überschätzung darstellt, da sich CD40-Flag-FasL in Aktivitätsmessungen wie ein homotrimeres Molekül verhält. Bindungsexperimente zeigen, dass CD40-Flag-FasL spezifisch durch CD40L-exprimierende Zellen immobilisiert und außerdem, nach Bindung die Ausbildung von Fas-Rezeptorclustern auf benachbarten Zellen induziert. CD40-Flag-FasL induziert in CD40L-transfizierten HT1080 und KB, nicht jedoch in parentalen Zellen, trotz ähnlicher Sensitivität dieser Zellen gegenüber Antikörper-vernetztem FasL, konzentrationsabhängig Apoptose und die Aktivierung von NFkappaB. Der EC50-Wert von CD40-Flag-FasL ist vier 10er Potenzen geringer in HT1080-CD40L im Vergleich zu HT1080 Zellen. Der induzierte Zelltod in CD40L-positiven Zellen beruht auf der Spaltung von Pro-caspase-8 und der Aktivierung von Caspase-3 und kann vollständig durch zVAD, Fas-Comp und einen humanen CD40L Antikörper inhibiert werden. Die CD40-Flag-FasL -induzierte Apoptose über einen parakrinen Weg in bystander Zellen gilt aufgrund Untersuchungen in vivo in Mäusen auf akute Toxizität für sicher, wohingegen artifizielles Vernetzen von CD40-Flag-FasL konzentrationsabhängig Leberversagen induziert. Die Resultate mit CD40-Flag-FasL führte zu der Klonierung von CD40-Flag-TRAIL Expressionskonstrukten, die CD40L-abhängig sowohl Apoptose als auch NFkappaB induzieren. Es konnte nicht nur gezeigt werden, dass die CD40-Flag-TRAIL-vermittelte Apoptose TRAIL-spezifisch ist, sondern auch, dass sie aus der Interaktion von CD40 und CD40L resultiert und von der Interaktion von TRAIL-R2 in sowohl KB-CD40L als auch HT1080-CD40L Zellen abhängig ist. Diese Ergebnisse stellen die Basis dar für die Entwicklung von sichereren, d.h. weniger toxischen FasL und TRAIL Derivaten für die Behandlung verschiedener humaner Pathologien.
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