Das konservierte Zellproliferationsgen CDC123 kodiert für einen Initiationsfaktor der Translation: 2gamma-AP

Abstract

Das Genprodukt von CDC123 in Saccharomyces cerevisiae ist essentiell und hochkonserviert. Es existieren Homologe in anderen niederen Eukaryonten ebenso wie in der Ackerschmalwand, dem Zebrafisch, der Maus oder auch dem Menschen. Ergebnisse zu dem orthologen Gen D123 aus einer Ratten-Fibroblastenzelllinie (3Y1) wurden erstmals 1984 publiziert. Es wurden konditionale Mutanten erzeugt, denen es bei restriktiver Temperatur nicht möglich war, in den Zellzyklus einzutreten und die DNA-Replikation zu initiieren. Das Interesse galt dabei der Identifikation neuer Regulatoren der Zellproliferation, um den Vorgang der Transformation hin zu unkontrolliert proliferierenden Zellen zu verstehen. Bei der Mutante 3Y1tsD123 konnte nach Inkubation bei restriktiver Temperatur ein Arrest in der G1-Phase des Zellzyklus beobachtet werden. Das mutierte Gen konnte kloniert und ein Nukleotidaustausch, der zu einem Aminosäureaustausch führte (A109V), nachgewiesen werden. Weitere Untersuchungen wiesen eine Proteasom-abhängige Instabilität dieses mutierten Proteins nach. Ebenso wurde eine teilweise granuläre Lokalisation von D123 im Cytoplasma und ein Kernausschluss beobachtet. Mögliche Phosphorylierungsstellen wurden ebenso beschrieben wie eine Homologie zu dem bis zum Beginn dieser Arbeit unbekannten ORF YLR215C in S. cerevisiae. YLR215C erhielt den Namen CDC123 in der Saccharomyces Genom Datenbank. In dieser Arbeit sollte CDC123 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht und eine molekulare Erklärung für die in Säugerzellen beobachteten Phänotypen gefunden werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Homologie von Cdc123 zu D123 nicht nur auf Sequenzebene existiert, sondern dass eine Deletion von CDC123 in Hefe durch das humane orthologe D123 komplementiert werden kann. Ebenso wie D123 in Säugerzellen ist auch Cdc123 in Hefe essentiell für den Eintritt in den Zellzyklus und das Verlassen der G1-Phase. Mit Hilfe der SGA-Analyse, der systematischen Suche nach synthetisch genetischen Interaktionen mit den ca. 4700 zur Verfügung stehenden Deletionen nicht essentieller Gene in S. cerevisiae, konnten 50 Gene identifiziert werden, die mit CDC123 in Verbindung stehen. Es waren Gene unterschiedlichster Bereiche zellulärer Funktion und Lokalisation dabei, die eine funktionale Einordnung von CDC123 allein aufgrund dieser Interaktionen unmöglich machte. Eine Gruppe von 6 Genen (GCN3, TIF1, TIF2, TIF3, TIF4631, TIF4632), allesamt Translationsinitiationsfaktoren, erschien vor dem Hintergrund einer publizierten Interaktion von Cdc123 mit Gcd11 vielversprechend. Daraufhin konnte ebenfalls eine synthetische Interaktion (letal, bzw. krank) zwischen cdc123-Mutanten und GCD11- bzw. SUI2-Allelen (Untereinheiten gamma und alpha des Initiationsfaktors eIF2) gefunden werden. Interaktionsstudien mit verschiedenen an der Translationsinitiation beteiligten Faktoren zeigten, dass Cdc123 ausschließlich mit eIF2 interagiert, nicht aber mit dessen Nukleotidaustauschfaktor eIF2B oder eIF3, Teil des Multifaktorkomplexes (MFC) und des 43S Präinitiationskomplexes. Die Interaktion kann in einem von Ribosomen geklärten Überstand, frei von der 40S oder 60S ribosomalen Untereinheit, stattfinden. Zusammen deutet dies auf eine Interaktion von Cdc123 mit Gcd11 in einem frühen Stadium der Translationsinitiation vor der Assoziation von eIF2 mit eIF3, d.h. dem MFC oder der 40S ribosomalen Untereinheit hin. Nach Inaktivierung von Cdc123-1 kann ein Verlust an Polysomen und eine Derepression der GCN4-Expression beobachtet werden. Sowohl das veränderte Polysomenprofil als auch die derepremierte GCN4-Expression sind Hinweise auf eine reduzierte Translationsinitiation. eIF2gamma wird, anders als die Untereinheiten alpha und beta, nach dem Verlust der Cdc123-Aktivität bei 25°C leicht und bei 37°C vermehrt instabil. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Abnahme der Gcd11-Menge nicht den primären Grund für die Wachstumsbeeinträchtigung der Cdc123-Mutanten darstellt. Vielmehr ist die Interaktion von eIF2gamma mit eIF2alpha und eIF2beta durch den Verlust der Cdc123-Aktivität stark reduziert. Dieser molekulare Befund wird als Ursache sowohl für den Arrest in der G1-Phase als auch für die reduzierte Translationsinitiation in Cdc123-Mutanten angesehen. In Übereinstimmung damit kann eine Deletion von CDC123, d.h. eine geringere Verfügbarkeit von eIF2 durch die Überexpression der Untereinheiten von eIF2 bedingt gerettet werden. Eine Überexpression der einzelnen Untereinheiten ermöglicht nur minimales Wachstum, wohingegen eine Kombination von eIF2gamma mit eIF2alpha oder aller drei Untereinheiten annähernd Wildtypwachstum zulässt. Cdc123 stellt somit einen neuen, für die Translationsinitiation essentiellen Faktor dar. Es ist notwendig für die effiziente Bereitstellung des eIF2-Komplexes, auf die möglicherweise über Cdc123 regulatorisch eingewirkt werden kann.

The gene product of CDC123 from Saccharomyces cerevisiae is essential and highly conserved. Homologues can be found in other low eukaryotes as well as in Arabidopsis, zebrafish, mouse or man. It was not before 1984 when first results from rat 3Y1 cells, an untransformed fibroblastic cell line, concerning the orthologue D123 were published. Conditional mutants were isolated, which could not initiate DNA replication and enter the cell cycle at restrictive temperature. The interest focused on the identification of new proliferation regulators to elucidate mechanisms leading to loss of proliferation control and cellular transformation. At restrictive temperature the conditional mutant 3Y1tsD123 lead to an arrest in G1 phase of the cellcycle. The mutated gene was cloned and a nukleotide exchange leading to an amino acid substitution (A109V) was identified. Further results demonstrated a proteasome dependent instability of the mutated protein. D123 did localize in the cytoplasm, partly in a granular pattern, but not in the nucleus. Possible phosphorylation sites where observed as well as a homology to the so far undescribed ORF YLR215C in S. cerevisiae. The ORF was named CDC123 in the Saccharomyces Genome Database. In this work CDC123 in S. cerevisiae should be examined to identify a molecular explanation for the observed phenotypes in mammalian cells. It could be shown that beside the observed similarity in sequence there also is a highly conserved functional homology. A deletion of CDC123 in S. cerevisiae could be rescued by expression of the human orthologue D123. As D123 in mammalian cells CDC123 in yeast is essential for cell cycle entry, for leaving the G1 phase. Utilizing a SGA screen, a systematic screening for synthetic genetic interactions with deletions of about 4700 non essential genes in S. cerevisiae, 50 genes connected with CDC123 were identified. Including genes of various cellular function and localisation it was impossible to deduce a function for Cdc123 just by genetic interactions. Nevertheless a group of 6 genes (GCN3, TIF1, TIF2, TIF3, TIF4631, TIF4632) which are all translation initiation factors, were quite interesting with a published physical interaction of Cdc123 with Gcd11 in mind. Mutations in cdc123 also led to a synthetic lethal or sick interaction with gcd11 or sui2 (eIF2 subunits gamma and alpha) alleles respectively. The following interaction studies with several initiation factors made clear that Cdc123 does interact with eIF2 exclusively and not with its exchange factor eIF2B or eIF3, part of the multi factor complex (MFC) and the 43S preinitiation complex. The interaction can take place in a post ribosomal supernatant free of 40S or 60S ribosomal subunits. Taken together, this suggests an interaction of Cdc123 with Gcd11 early in translation initiation before MFC or 43S assembly. After inactivation of Cdc123-1 a reduced amount of polysomes and a derepression of GCN4 expression could be observed. Loss of polysomes and GCN4 derepression are both indicators of a defect in translation initiation. eIF2gamma does get instable at 25°C after loss of Cdc123 activity. This instability is increased at 37°C. However, it could be demonstrated that the abatement of Gcd11 is not the primary cause for the observed growth phenotype of cdc123 mutants. The interaction of eIF2gamma with eIF2alpha or eIF2beta is greatly reduced after loss of Cdc123 function. This molecular phenotype is more likely to cause the diminished translation initiation and the observed accumulation of cells in G1 in cdc123 mutants. Consistent with this a deletion of CDC123, i.e. a diminished availability of eIF2 complex, can partly be rescued by the overexpression of eIF2 subunits. Overexpression of single subunits only allows minimal growth whereas co-overexpression of eIF2gamma with eIF2alpha or all three subunits almost can restore wildtype growth. Hence Cdc123 can be seen as a factor necessary for efficient translation initiation by limiting the availability of eIF2. Regulation of this step via Cdc123 activity could be possible.