Mikrobielle Biosynthese von (3S,4R)-4-Amino-3-hydroxycyclohexa-1,5-diencarbonsäure mit rekombinanten Escherichia coli-Zellen : molekulargenetische und biochemische Untersuchungen

Abstract

Ziel dieser Arbeit war die mikrobielle Biosynthese des Aminocyclitols (3S,4R)-4-Amino-3-hydroxycyclohexa-1,5-diencarbonsäure (3,4-CHA) aus dem nachwachsenden Rohstoff Glu-kose; sie sollte ausgehend von Chorisminsäure über das Intermediat 4-Amino-4-desoxychoris-minsäure (ADC) ablaufen. Chorisminsäure ist der zentrale Verzweigungspunkt bei der Bio-synthese von aromatischen Verbindungen in Escherichia coli, ADC tritt in E. coli als Inter-mediat bei der Biosynthese von p-Aminobenzoesäure auf. Durch eine für E. coli nicht physiologische Etherspaltung sollte dann ADC zum Zielprodukt 3,4-CHA und Pyruvat umge-setzt werden. Da zu Beginn dieser Arbeit kein Enzym beschrieben worden war, das diese Reaktion katalysiert, war zunächst nicht bekannt, ob und mit welchem Enzym diese Reaktion durchführbar sein würde. Zunächst wurde das vermutete Gen einer ADC-Synthase, pabAB, aus Corynebacterium gluta-micum in den Expressionsvektor pJF119EH kloniert. Der E. coli-Stamm KB532, ein Stamm mit einem erhöhten Stofffluss zu Chorisminsäure, wurde anschließend mit dem Plasmid transformiert und fermentiert. Im Fermentationsüberstand wurden 7 g/l ADC und 15,4 g/l Chorisminsäure nachgewiesen. Somit konnte ein ADC-produzierender E. coli-Stamm etab-liert und gezeigt werden, dass das Gen pabABC.gl. eine aktive ADC-Synthase kodiert. Um ein geeignetes Konstrukt für die Umsetzung von ADC zu 3,4-CHA zu erhalten, wurde das Gen His10-phzD, das ein Fusionsprotein der Isochorismatase PhzD aus Pseudomonas aeruginosa mit einem aminoterminalen Histidinschwanz kodiert, zusammen mit pabABC.gl. in den Expressionsvektor pJF119EH kloniert. Dieses Plasmid wurde anschließend in den E. coli-Stamm KB532 transformiert. Bei einer Fermentation des erzeugten Stammes konnte im Kul-turüberstand eine maximale Produktkonzentration von 2,8 g/l 3,4-CHA erreicht werden; die Cyclohexadiendiolcarbonsäure (3S,4R)-3,4-Dihydroxycyclohexa-1,5-diencarbonsäure (3,4-CHD) trat hierbei als Nebenprodukt auf. Das Verhältnis von gebildetem 3,4-CHA zu 3,4-CHD schwankte je nach Fermentationsbedingungen und -dauer zwischen 1:1 und 1:3. Die erreichten Produktausbeuten zeigen, dass PhzD sowohl ADC als auch Chorisminsäure als Substrate akzeptiert und diese zu 3,4-CHA und Pyruvat bzw. 3,4-CHD und Pyruvat umsetzt. Dies war auch während der Durchführung dieser Arbeit berichtet worden (Parsons, J. et al. (2003) Biochemistry 42: 5684-5693), jedoch war die bei der Fermentation erhaltene 3,4-CHA-Produktausbeute größer, als die veröffentlichten Ergebnisse erwarten ließen. Die Isochorismatase PhzD aus Pseudomonas aeruginosa und die Isochorismatase EntB aus Escherichia coli wurden biochemisch charakterisiert. Das phzD-Gen wurde kloniert und als Fusionsprotein mit einem aminoterminalen 10-fachen Histidinschwanz überexprimiert; entB wurde ebenfalls kloniert und mit einem 6-fachen carboxyterminalen Histidinschwanz über-exprimiert. Ausgehend vom Rohextrakt eines rekombinanten E. coli-Stamms wurden die bei-den Enzyme in einem Schritt mittels Ni2+-Affinitätschromatographie bis zur apparenten Ho-mogenität aufgereinigt. Die Ausbeute betrug hierbei je Liter Expressionskultur 20 mg EntB-Fusionsprotein bzw. 25 mg PhzD-Fusionsprotein. Von beiden aufgereinigten Enzymen wur-den die kinetischen Parameter für die Substrate ADC und Chorisminsäure mit einem ge-koppelten Enzymtest bestimmt. Bei einem pH-Wert von 7,5 und einer Temperatur von 37 °C wurden für PhzD die folgenden Werte für kcat und KM ermittelt. Für das Substrat ADC beträgt der KM-Wert 1,5 ± 0,3 mM und kcat ist 4,1 ± 0,12 s-1; bei dem Substrat Chorisminsäure beträgt der KM-Wert 1,2 ± 0,15 mM und kcat 39 ± 0,8 s-1. Für das Enzym EntB wurden unter den gleichen Bedingungen für das Substrat ADC ein KM-Wert von 1,4 ± 0,3 mM und ein kcat-Wert von 2 ± 0,05 s-1 bestimmt. Für das Substrat Chorisminsäure betrug der KM-Wert 1,1 ± 0,15 mM und kcat 56 ± 3 s-1. Die kinetischen Parameter zeigen, dass mit beiden Enzymen die Um-setzung von ADC zu 3,4-CHA und Pyruvat möglich ist. PhzD ist jedoch hierfür besser geeig-net, während sich EntB besser für die Umsetzung von Chorisminsäure zu 3,4-CHD und Pyruvat eignet. Die ermittelten kinetischen Parameter für PhzD unterscheiden sich von den bereits veröffentlichten Werten (Parsons, J. et al. (2003) Biochemistry 42: 5684-5693). Wäh-rend die Werte für KM in der gleichen Größenordnung liegen, sind die bestimmten Werte für kcat für die beiden Substrate Chorisminsäure und ADC deutlich größer als beschrieben.

The purpose of this thesis was the microbial biosynthesis of aminocyclitol (3S,4R)-4-amino-3-hydroxycyclohexa-1,5-dienecarboxylic acid (3,4-CHA) from glucose resulting from a synthesis starting with chorismic acid via the intermediate 4-amino-4-deoxychorismate (ADC). Chorismic acid is the central branchpoint in the biosynthesis of aromatic compounds in Escherichia coli. ADC is an intermediate in the biosynthesis of folic acid in E. coli. An ether cleavage, non-physiological for E. coli, should yield the target compound 3,4-CHA along with pyruvate. This conversion has not been described in literature prior to the beginning of this thesis and it was uncertain whether it would actually be possible. First, the putative gene of an ADC-synthase in Corynebacterium glutamicum, pabABC.gl., was cloned in the expression vector pJF119EH. The plasmid was then transformed in E. coli-strain KB532, which has an increased flux towards chorismic acid. Upon fermentation, this strain yielded 7g/l ADC along with 15,4 g/l chorismic acid in the fermentation broth. Thus, an ADC-producing strain was established and proof was given that the gene pabABC.gl. encodes for an active ADC-synthase. To get a suitable construct for the conversion of ADC to 3,4-CHA, the gene his-phzD, which encodes for a fusion protein of isochorismatase PhzD from Pseudomonas aeruginosa with an amino-terminal histidin-tag was cloned in the expression vector pJF119EH together with pabABC.gl.. This construct was transformed into KB532 and upon fermentation, this strain yielded 2,8 g/l 3,4-CHA along with cyclohexadienediol (3S,4R)-3,4-dihydroxycyclohexa-1,5-dienecarboxylic acid (3,4-CHD) as byproduct. The ratio of 3,4-CHA to 3,4-CHD varied between 1:1 and 1:3 depending on fermentation conditions. These product yields indicate that PhzD accepts both, ADC and chorismic acid, as a substrate and converts them to 3,4-CHA and pyruvate or 3,4-CHD and pyruvate. This has also been reported in the meantime (Parsons, J. et al. (2003) Biochemistry 42: 5684-5693), although the resulting 3,4-CHA yield in the fer-mentation was much higher than expected according to the published data. Both isochorismatase PhzD from Pseudomonas aeruginosa and isochorismatase EntB from Escherichia coli have been characterized biochemically. The phzD-gene has been cloned and overexpressed as a fusion protein with a 10-fold amino-terminal histidin-tag, entB has been cloned as well and was overexpressed as a fusion protein with a 6-fold carboxy-terminal histidin tag. Both enzymes were purified to apparent homogeneity in a one-step purification by Ni2+-affinity chromatography from crude extract of recombinant E. coli-strains. The protein yield for EntB was 20 mg per liter expression culture and for PhzD 25 mg per liter expression culture. For both purified enzymes the kinetic constants have been determined by a coupled enzymatic assay at pH 7,5 and 37 °C. For the enzyme PhzD, KM is 1,5 ± 0,3 mM and kcat is 4,1 ± 0,12 s-1 for the substrate ADC, KM is 1,2 ± 0,15 mM and kcat is 39 ± 0,8 s-1 for the substrate chorismic acid. For the enzyme EntB and the substrate ADC values are 1,4 ± 0,3 mM for KM and 2 ± 0,05 s-1 for kcat. For the substrate chorismic acid values for KM and kcat have been determined to be 1,1 ± 0,15 mM and 56 ± 3 s-1. These kinetic constants show, that both enzymes are capable of converting ADC to 3,4-CHA and pyruvate. While EntB is better suited to convert chorismic acid to 3,4-CHD and pyruvate, PhzD is the better enzyme for the conversion of ADC to 3,4-CHA and pyruvate. The measured kinetic constants differ from those previously reported (Parsons, J. et al. (2003) Biochemistry 42: 5684-5693). The values for KM are about the same order of magnitude, but the values for kcat are significantly higher than the published data.