Identifizierung zweier Gencluster (atuABCDEFGH, liuRABCDE) in Pseudomonas aeruginosa PAO1 und deren funktionelle Analyse im Metabolismus methylverzweigter Verbindungen

Abstract

Azyklische Terpene wie Citronellol und Geraniol sind in der Natur weit verbreitete Geruchsstoffe, die aufgrund ihrer β-methylverzweigten Struktur von Mikroorganismen nur schwer metabolisiert werden können. In der vorliegenden Arbeit wurde der Abbau azyklischer Terpene in Pseudomonas aeruginosa PAO1 untersucht.

1. Durch Insertionsmutagenesen wurden zwei Gencluster identifiziert, die für die meisten der in früheren biochemischen Beiträgen postulierten Abbauschritte codieren. Das erste Gencluster besteht aus acht Genen und einem potentiellen Regulatorgen und entspricht den Genprodukten der ORF PA2885 bis PA2993 der P. aeruginosa PAO1 Datenbank. Das zweite Gencluster (gny-Cluster), welches durch Diaz-Perez und Mitarbeiter identifiziert wurde [DIAZ-PEREZ et al. (2004), Appl Environ Microbiol 70: 5102] besteht aus fünf Genen und einem vermeintlichen Regulatorgen und entspricht den Genprodukten der ORF PA2016 bis PA2011. 2. Insertionen im ersten Gencluster (PA2890 und PA2891) führten zu einem Verlust des Wachstums auf azyklischen Terpenen, die Fähigkeit zum Wachstum auf Leucin und Isovaleriansäure war nicht beeinträchtigt. Insertionen im zweiten Gencluster (PA2012 und PA2013) führten hingegen zum Verlust des Wachstums sowohl auf azyklischen Terpenen (Citronellol, Geraniol) als auch auf Leucin und Isovaleriansäure. Das erste Gencluster wurde als atu- (acyclic terpene utilization) Gencluster bezeichnet, das gny-Cluster wurde in das liu- (leucine/isovalerate utilization) Gencluster umbenannt. 3. Der aus biochemischen Untersuchungen postulierte Abbauweg von Citronellol enthält zwei charakteristische Carboxylierungsschritte (Geranyl-CoA-Carboxylase [GCase] und Methylcrotonyl-CoA-Carboxylase [MCase]). Diese wandeln die β-Methylverzweigungen in Acetatseitengruppen um, welche in anschließenden enzymatischen Reaktionen abgespalten werden. Beide Carboxylasen wurden durch Avidin-Affinitätschromatographie aus Zellextrakten gereinigt und durch Trypsin-Fingerprint-Massenspektrometrie als Genprodukte von PA2888/PA2891 (atuD/atuF; GCase) bzw. als Genprodukte von PA2014/PA2012 (liuB/liuD; MCase) eindeutig identifiziert. Durch Western-Blot Analysen und Aktivitätsbestimmungen der GCase und MCase wurde bestätigt, dass die GCase (AtuF) nur beim Wachstum auf Citronellol, die MCase (LiuD) sowohl beim Wachstum auf Citronellol als auch beim Wachstum auf Leucin bzw. Isovaleriansäure induziert wurde. 4. Für die übrigen Genprodukte des atu- und liu-Genclusters konnten die möglichen biochemischen Funktionen durch Datenbankvergleiche vorhergesagt werden. 5. Vorausgesagte Genprodukte mit hohen Ähnlichkeiten zu den Genprodukten des liu-Clusters konnten in anderen Pseudomonaden (P. putida KT2440, P. fluorescens Pf-5, P. syringae tomato DC3000) nachgewiesen werden. Vorausgesagte Proteine mit hohen Ähnlichkeiten zu den Genprodukten des atu-Clusters konnten nur in P. fluorescens Pf-5 festgestellt werden, der als einziger dieser Pseudomonaden in der Lage ist, Citronellol als Kohlenstoffquelle zu verwerten. 6. Das atu-Cluster aus P. aeruginosa PAO1 konnte in die Pseudomonaden P. putida, P. fluorescens GK13 und P. oleovorans übertragen werden. Keiner dieser rekombinanten Stämme war anschließend in der Lage, Citronellol und Geraniol als Kohlenstoffquelle verwerten, so dass offenbar noch weitere, bislang unbekannte Gene für einen funktionellen Abbauweg notwendig sind. 7. Die Untersuchungen von weiteren Transposoninsertionsmutanten und Hemmversuche mit Wolframat ergaben, dass die Oxidation von Geraniol über molybdänabhängige Schritte verläuft, und somit unterschiedlich zur Oxidation von Citronellol ist. Weiterhin zeigte sich, dass das moeA2-Gen (ORF PA3028), welches an der Molybdäncofaktor-Biosynthese beteiligt ist, für die Verwertung von Geraniol essentiell ist.

Acyclic terpenes like citronellol and geraniol are widespread odours in nature which are difficult to metabolize for microorganisms due to their β-methyl branched structures. Degradation of acyclic terpenes by Pseudomonas aeruginosa PAO1 was investigated in the present work.

1. Two gene clusters were identified by insertion mutagenesis, which code for the most degradation steps postulated in earlier biochemical studies. The first gene cluster is composed of eight genes and one potential regulator gene and corresponds to the gene products of ORF PA2885 to PA2893 of the P. aeruginosa PAO1 database. The second gene cluster (gny-cluster), which was independently identified by Diaz-Perez and coworkes [DIAZ-PEREZ et al. (2004), Appl Environ Microbiol 70: 5102] and by me, contains five genes and a probable regulator gene and corresponds to the gene products of ORF PA2016 to PA2011. 2. Insertions in the first gene cluster (PA2890 and PA2891) resulted in loss of ability to utilize and to grow on acyclic terpenes while growth on leucine and isovalerate was not affected in the respective mutants. Insertions in the second gene cluster (PA2012 and PA2013) resulted in loss of growth on both acyclic terpenes (citronellol, geraniol) and on leucine and isovalerate. The first gene cluster was named as atu- (acyclic terpene utilization) cluster, the gny-cluster was renamed liu- (leucine/isovalerate utilization) cluster. 3. The degradation pathway of citronellol contains two characteristic carboxylation steps (geranyl-CoA carboxylase [GCase] and methylcrotonyl-CoA carboxylase [MCase]). These carboxylation steps convert the β-methyl branched group of geranyl-CoA and methylcrotonyl-CoA to acetate side chains which are cleaved off in subsequent enzymatic steps. Both carboxylases were purified from crude extracts by avidin-affinity chromatography and were unequivocally identified as gene products of PA2888/PA2891 (atuD/atuF; GCase) and gene products of PA2014/PA2012 (liuB/liuD; MCase) by trypsin-fingerprint-mass spectrometry, respectively. Activity determinations of GCase and MCase as well as Western blot analysis confirmed that GCase was only induced by growth on citronellol. MCase was induced by growth on citronellol as well as on leucine and isovalerate, respectively. 4. Plausible biochemical functions of the other gene products from the atu- and liu- gene clusters were predicted by database analysis. 5. Predicted gene products with high similarity to gene products of the liu cluster were found in different pseudomonads (P. putida KT2440, P. fluorescens Pf-5, P. syringae tomato DC3000). Predicted proteins with high similarity to the atu cluster were only found in P. fluorescens PF-5. The latter is the only strain of these pseudomonads able to use citronellol as sole source of carbon and energy. 6. The atu-cluster of P. aeruginosa PAO1 was transferred to P. putida KT2440, P. fluorescens Pf-5 and P. syringae tomato DC3000. None of the recombinant strains was able to use citronellol and geraniol as carbon source. Thus, it is likely that so far other unknown genes are needed for a functional degradation pathway. 7. Investigations of additional transposon mutants of P. aeruginosa and inhibition tests with tungstate revealed that oxidation of geraniol but not of citronellol requires molybdenum-dependent steps and is therefore different to the oxidation of citronellol. This conclusion is in agreement with the finding that the moeA2 gene (PA3028), which is involved in molybdenum cofactor biosynthesis, is essential for geraniol degradation.