DNA-Microarrays zur therapiebegleitenden Prognose bei Brustkrebs

Abstract

Der Kern der Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und Validierung eines DNA-Microarrays, der zur therapiebegleitenden Prognose bei Brustkrebserkrankungen eingesetzt werden soll. Das Fernziel ist es, diesen DNA-Microarray in der klinischen Routine einzusetzen. Das Vorhaben gründet sich auf der Tatsache, dass ca. 70 - 80 % aller erkannten Mamma-karzinome keine Chemotherapie zur Ausheilung benötigen. Derzeit gibt es jedoch keine Methoden diese Brustkrebstypen zu erkennen und entsprechend andere Therapieformen anzuwenden. Trotz therapeutischer Behandlungsmaßnahmen liegt die Überlebensrate bei den restlichen 30 - 20 % der Mammakarzinom-Patientinnen, über einen Zeitraum von 5 Jahren hinaus betrachtet, bei lediglich 10 %. In diesem Ansatz wird angestrebt neue Marker auf Transkriptionsebene zu finden, um hier eine verbesserte Prognose zu ermöglichen, da es bisher nur 2-3 etablierte Marker (ER-Status, HER2), sowie eine Beurteilung nach dem Lymphknotenstatus gibt. Das hier verwendete Genkollektiv gründet sich auf ausführlicher Literaturrecherche und deckt sowohl therapeutisch bedeutsame Gene, als auch Sequenzen, die Tumortyp, den Östrogenrezeptorstatus und die Signaltransduktionswege repräsentieren, ab. Ein erstes Ergebnis dieser Arbeit war, dass anhand basaler Transkriptionsmuster zweier humaner Brustkrebszelllinien, ein sog. Set an Klassifikatorgenen bestimmt wurde, mit denen die beiden Zelllinien eindeutig voneinander unterschieden werden konnten. In ersten Versuchen konnte mit der linearen RNA-Amplifikation gezeigt werden, dass mit dieser Technik lediglich 60 % der ursprünglich detektierbaren Gene erhalten blieb, diese gemeinsamen Gene jedoch das gleiche Expressionsverhalten zeigten. Die Validierung des DNA-Microarrays an einer mit Antiöstrogen stimulierten humanen Brustkrebszelllinie zeigte im Vergleich zum unstimulierten Zustand 33 differentiell regulierte Gene. Unter diesen Genen befanden sich CDKN1A und TFF1, welche direkt von Östrogen und Antiöstrogen reguliert werden können. Diese Ergebnisse wurden durch unabhängige Methoden überprüft und zeigten sehr ähnliche Expressionsverhältnisse. Nach Entwicklung eines Zweifarben-Systems zur Detektion von indirekt-markierten Proben erfolgte das Tumorscreening an zunächst 24 Gewebeproben (21 Tumor-, 3 Normalgewebe). Die statistische Auswertung ergab zwei Genkollektive. Das erste Genset zur Unterscheidung von ER+- und ER--Geweben erstreckte sich über 33 Gene. Das zweite Genkollektiv, mit dem Normal- von Tumorgewebe unterschieden werden kann, beinhaltete 23 Gene. Die Überprüfung dieser Ergebnisse erfolgte parallel mit einem kommerziell erhältlichen DNA-Microarray. Neben einer Übereinstimmung von gemeinsam exprimierten Genen, zeigten die beiden Chipsysteme vor allem aber auch ähnliche Ergebnisse bei nicht detektierbaren Genen, d.h. von solchen Sequenzen deren Expression vom Hintergrundsignal nicht zu unterscheiden war. Die vorliegende Arbeit ist Teil eines Verbundforschungsprojektes zwischen dem Fraunhofer Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik (IGB) Stuttgart, dem Robert-Bosch-Krankenhaus (RBK) Stuttgart, dem Institut für Zellbiologie und Immunologie (IZI), dem Mathematischen Institut A (MIA) (beide Universität Stuttgart) sowie dem Interfakultären Institut für Zellbiologie (IZT) der Universität Tübingen.

The main part of this work dealt with development and validation of a DNA-microarray, which should be applied to accompany measures in therapy of breast cancer. Long-term objective of this project is using this DNA-microarray in clinical practice. The intention is based on the fact, that about 70 - 80 % of all diagnosed breast carcinomas need any chemotherapy for curing. Actually there are no methods to indentify these types of breast tumors in order to choose other, maybe better suited therapies. The remaining 30 - 20 % of mamma carcinoma patients will only have an overall survival rate within 5 years by 10 %, despite of a therapeutic treatment. This approach is aimed to identify new markers on transcriptional level improving prognosis, because there are only 2 to 3 established markers (i.e. status of ER or HER2/neu), like also nodal status. The applied gene set is based on extensive literature research and covers genes significant in therapy, tumor type specific and ER representing sequences, like also many components of signal transduction pathways. A first result of this work was identifying a gene set, which distinguishes the two human breast cancer cellines, MCF 7 and MDA-MB 231, based on their expression profiles. Initial experiments of linear RNA-amplification have shown, that only 60 % of primarily detectable genes remained. In comparison to experiments without RNA-amplification these set of genes indicated similar expression tendencies. Array validation was performed by a model system containing the antiestrogen- and un- stimulated human breast cancer celline MCF 7. The experiment provided 33 differential genes (p ≤ 0.05). This set of genes contains also, CDKN1A and TFF1, both regulated by estrogen and antiestrogen directly. This results were checked and confirmed by independent methods. After developing a two color detection system for indirect-labeled probes, a initial tumor screen was performed with 24 specimens (21 tumors and 3 normal tissues). Statistical data analysis points out two sets of genes. The first set contains 34 genes which distinguishes ER+ from ER- tumors. The second set including 23 genes could be used to differentiate normal tissues from tumors. Examination of these results was carried out with a commercial available DNA-microarray. The other system showed an accordance in the case of collectively expressed genes, as well by genes which couldn‘t be detected by both chip systems, because there are no differences to backround. This work is part of a network research project between Fraunhofer Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik (IGB) Stuttgart, Robert-Bosch-Krankenhaus (RBK) Stuttgart, Institut für Zellbiologie und Immunologie (IZI), Mathematischen Institut A (MIA) (both University of Stuttgart) and Interfakultären Institut für Zellbiologie (IZT), University of Tübingen.