Microbial aldolases as C-C bonding enzymes : investigation of structural-functional characteristics and application for streoselective reactions

Abstract

Carbon-carbon bonding enzymes can be attractive alternatives to standard chemical methods by allowing chiral control, taking advantage of mild reaction conditions and minimizing the use of protecting groups in reactions. Fructose-6-phosphate aldolase (FSA) from Escherichia coli catalyses reversibly the cleavage of D-fructose-6-phosphate into dihydroxyacetone (DHA) and D-glyceraldehyde-3-phosphate (GAP). In addition, the enzyme creates new building blocks with 3S, 4R configuration by use of DHA as donor and various aldehydes as acceptor. The goal of this work was to investigate FSA and compare it with the transaldolase from Bacillus subtilis (TALBsu) which is similar both in sequence and structure to FSA (30% identical in amino acid residues). This should help to elucidate relationships between structure and function of both enzymes, and possible applications for FSA and TALBsu for the production of valuable sugars or sugar derivatives. Both fsa and talBsu genes were cloned with Histidine tags (6x or 10x His-tag) at the N- or C-termini to facilitate purification of the proteins. However, none of these fusion proteins (N-tagged FSA, C-tagged FSA, N-tagged TALBsu, C-tagged TALBsu) retained the complete enzyme activity. Both N-tagged FSA and TALBsu did not bind to Ni-NTA column, whereas both C-tagged enzymes bound to the resin and they could be purified. Concerning quaternary structures, N- or C-tagged TALBsu formed dimer or pentamer, while both His-tagged FSAs kept the decamer structures. This result demonstrated that His-tag would give negative influences on both FSA and TALBsu, and it was unsuitable for assay of those enzymes. In addition, FSA had different structural stability from that of TALBsu. To examine the importance of several residues at the active center in FSA, three FSA mutants (Q59E, Y131A and Y131F) were prepared so as to have the corresponding amino acid residues that are present in TALBsu and several other TALs (Gln -> Glu, Tyr -> Phe). The purified FSA Q59E protein retained approximately 66% of the wild type (WT) activity, whereas both Y131A and Y131F were completely inactive, though all three retained their decameric structures. From three-dimensional structural analysis of FSA Q59E (by the group of G. Schneider at Karolinska Institute, Stockholm), it appeared that the mutant protein's structure is identical to WT. Each mutant lost stability at high temperature and was thus denatured by heat treatment (75°C, 40min). This suggested that the Tyr131 residue has an important role for FSA activity. Indeed, a hydroxyl group at the phenyl moiety of the residue appears to be indispensable for the catalytic reaction, as the structural balance of FSA was lost by the alteration of Tyr131. Another mutant of FSA, A129S, was assayed for its synthetic capability and compared with FSA WT. Both WT and A129S catalyzed two reactions using DHA as donor with formaldehyde or glycolaldehyde as acceptor and produced S-erythrulose or D-xylulose, respectively. However, A129S showed much higher activity thus yielding larger amounts of products. On the other hand, almost no difference was observed in catalytic ability between WT and A129S for a reaction using hydroxyacetone as donor. It is supposed that a hydroxyl moiety of DHA interacts with the hydroxyl group of Ser129 in FSA A129S via a hydrogen bond and changes the affinity of the enzyme towards DHA. As further synthetic reactions, aminoaldehydes were assayed as acceptors for FSA. FSA recognized N-Cbz-3-aminopropanal with DHA and an aldol adduct (a precursor of fagomine) was produced even at 4 °C (performed by the group of P. Clapes in CSIC, Barcelona). This indicates a high utility of FSA in organic syntheses, the enzyme indeed could recognize large molecules including a benzene ring as acceptor and retains catalytic ability at rather low temperature. To evolve diverse catalytic abilities of FSA and progress further application of the enzyme, random mutagenesis was adopted by use of error prone PCR technique. As a result, various mutant proteins were acquired with the alteration of 1 to 6 residues per gene. This implies that FSA mutants can be prepared with this technique and enzyme libraries could be created. To compare FSA with TALBsu in structure, wild-type TALBsu was cloned in E. coli and purified. Three-dimensional structure analysis (by T. Sandalova in the group of G. Schneider in Karolinska Institute, Stockholm) revealed that the enzyme is a decameric protein (10 subunits of 23kDa) resulting from the dimerization of two identical pentamers. This makes TALBsu highly similar to FSA in structure with the exception only of a shorter C-terminal helix. TALBsu was tolerant of high temperature as FSA (at 75°C for 30-40min), and recognized different aldehydes or their phosphate derivatives as acceptors (Fru6P as donor). DHA was utilized as donor at a specific activity of about 10% of a reaction using Fru6P. Eight chimera proteins (chimera1-8) consisting of parts of FSA and progressively truncated TALBsu were designed and overexpressed in E. coli to probe structural determinants for each enzyme. However, several chimera samples (chimera1, 3, 6) showed only faint protein bands on SDS-PAGE and two (chimera2, 7) were not detected. All cell-free extracts of chimera proteins showed neither FSA nor TALBsu activity.

C-C-Bindungen knüpfende Enzyme können attraktive Alternativen zu normalen chemischen Methoden zur Bildung neuer chiraler Gruppen sein, damit Reaktionen unter milderen Bedingungen ablaufen können. Fruktose-6-Phosphat Aldolase (FSA) aus Escherichia coli katalysiert die reversible Spaltung von D-Fruktose-6-Phosphat zu Dihydroxyaceton (DHA) und D-Glycerinaldehyd-3-Phosphat (GAP). Außerdem bildet das Enzym neue Bausteine mit 3S, 4R-Konfiguration unter Verwendung von DHA als Donor und verschiedenen Aldehyden als Akzeptor. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von FSA im Vergleich zur Transaldolase aus Bacillus subtilis (TALBsu). Die Transaldolase besitzt eine ähnliche Sequenz und Struktur wie FSA (30% identische Aminosäurereste). Dies sollte dabei helfen, die Beziehungen zwischen Struktur und Funktion beide Enzyme aufzuklären, und mögliche Anwendungen für FSA und TALBsu für die Produktion von hochwertigen Zuckern und Zuckerderivaten, zu untersuchen. Die fsa und tal Gene wurden jeweils mit Histidin-Tag (6x or 10x His-tag) am N- bzw. C-Terminus kloniert, um die Reinigung der Proteine zu erleichtern. Keines dieser Fusionsproteine (FSA N-His-Tag, FSA C-His-Tag, TALBsu N-His-Tag, TALBsu C-His-Tag) besaß die volle Enzymaktivität. FSA N-His-Tag und TALBsu N-His-Tag banden nicht an eine Ni-NTA-Matrix. Die beiden Enzyme mit C-Terminalem His-Tag interagierten mit der Matrix und wurden aufgereinigt. Bezüglich ihrer Quartärstruktur bildete das TALBsu N-His-Tag oder TALBsu C-His-Tag Dimere oder Pentamere. Hingegen behielten beide FSA His-Tag die Dekamerenstruktur bei. Dieses Ergebnis zeigte, dass der His-Tag einen negativen Einfluß auf die Enzyme ausüben kann. Zur Untersuchung der wichtigen Aminosäuren im aktiven Zentrum von FSA wurden drei verschiedene Mutanten des Enzyms hergestellt. Dabei wurden die Aminosäurereste zu den korrespondierenden Resten des TALBsu und den anderer Transaldolasen ausgetauscht (Gln -> Glu, Tyr -> Phe). Das gereinigte FSA Gln59Glu Protein behielt ungefähr 66% der Aktivität des Wildtyps bei, hingegen waren beide Tyr131 Mutanten (Y131A und Y131F) inaktiv. Alle drei Mutanten behielten ihre dekamere Struktur bei. Die Analyse der dreidimensionalen Struktur von FSA Gln59Glu (Messungen wurden von der Gruppe von G. Schneider am Karolinska Institut, Stockholm, durchgeführt), zeigte, dass die Struktur des Mutantenproteins identisch mit dem Wildtyp war. Alle Mutanten verloren ihre Stabilität während der Hitzefällung und denaturierten (75°C, 40min). Das Ergebnis deutet an, dass die Aminosäure Tyr131 eine wichtige Rolle für die FSA Aktivität hat. Es könnte sein, dass die Hydroxylgruppe des Phenylrests der Aminosäure für die katalytische Reaktion notwendig ist. Eine andere Mutante, FSA A129S, wurde auf ihre Synthesefähigkeit hin untersucht und mit dem FSA Wildtyp verglichen. Beide, FSA Wildtyp und Mutante A129S, katalysieren die Reaktionen mit DHA als Donor und Formaldehyd oder Glykolaldehyd als Akzeptor. Dabei wird S-Erythrulose bzw. D-Xylulose gebildet. Jedoch zeigte FSA A129S höhere Aktivitäten und größere Mengen der Produkte wurden gebildet. In der Katalyseeigenschaft des Wildtyps und der Mutante A129S wurde bei Hydroxyaceton als Donor kein Unterschied wahr genommen. Es wird vermutet, dass eine Hydroxylgruppe von DHA mit der Hydroxylgruppe von Ser129 auf FSA A129S über eine Wasserstoffbrücke interagiert und so die Affinität des Mutantenenzyms zu DHA verändert. Als Synthesereaktion von FSA wurden Aminoaldehyde als Akzeptoren eingesetzt. FSA erkannte N-Cbz-3-Aminopropanal mit DHA und die Aldolprodukte (Vorläufer von Fagomin) wurden sogar bei 4°C produziert (durchgeführt von der Gruppe P. Clapes in CSIC, Barcelona). Dies zeigt den hohen Nutzen von FSA in organischen Synthesen. So konnte das Enzym ein großes Molekül, einschließlich eines Benzolringes, als Akzeptor erkennen und behielt trotzdem die katalytische Fähigkeit auch bei niedriger Temperatur bei. Zur Entwicklung erweiterten Einsatzmöglichkeiten der FSA wurden zufällige Mutationen mittels einer "error prone PCR" eingeführt. Pro FSA-Mutante fanden 1-6 Aminosäureaustausche statt. Das bedeutet, dass FSA Mutanten vorbereitet werden können und eine Gen-Bibliothek für das Enzym erstellt werden kann. Wildtyp TALBsu wurde in E.coli kloniert und gereinigt, um die Struktur mit der von FSA zu vergleichen. Die Analyse der dreidimensionalen Struktur (durchgeführt von T. Sandalova in der Gruppe von G. Schneider am Karolinska Institut, Stockholm) zeigte, dass TALBsu eine dekameres Protein ist (10 Untereinheiten von 23kDa) und aus zwei identischen Pentameren zusammengesetzt ist. Die Struktur von TALBsu macht die Ähnlichkeit zur Struktur von FSA deutlich mit der Ausnahme der kürzeren C-terminalen Helix. TALBsu ist ein thermostabiles Protein ähnlich wie FSA, und erkennt verschiedene Aldehyde oder Zuckerphosphatderivate als Akzeptor (mit Fru6P als Donor). Wenn DHA als Donor verwendet wurde, zeigte TALBsu eine spezifische Aktivität von etwa 10% bezüglich Fru6P als Donor. Acht chimäre Proteine (Chimäre1-8) bestehend aus jeweils einem Teil der FSA Sequenz und einem Teil der TALBsu Sequenz wurden konstruiert und die Proteine in E.coli exprimiert, um die Strukturdeterminanten für jedes Enzym zu untersuchen. Nur einige chimäre Proteine (Chimäre 1, 3, 6) zeigten sich als eine schwache Bande in der SDS-PAGE. Alle Rohextrakte der chimären Proteine zeigten weder eine FSA noch eine TALBsu Aktivität.