Design metabolischer Stoffwechselsysteme am Beispiel der Tryptophansynthese in Escherichia coli

Abstract

Zielgerichtete gentechnische Veränderungen, die gewünschte Stoffwechseleigenschaften von Mikroorganismen ermöglichen oder verbessern, haben zur heutigen Wettbewerbsfähigkeit fermentativer Prozesse beigetragen. Da Mikroorganismen komplexe Stoffwechselsysteme darstellen, in denen Eigenschaften des Gesamtsystems über die Eigenschaften seiner Bausteine hinausgehen, können lohnende Ziele für gentechnische Veränderungen häufig nicht intuitiv erfasst werden. Die Formulierung mathematischer Stoffwechselmodelle, die das vorhandene Wissen über den Stoffwechsel von Mikroorganismen sammeln und präzisieren, stellt ein wichtiges Werkzeug dar, die bekannte Komplexität des Stoffwechsels beim Entwurf neuer oder veränderter Stoffwechseleigenschaften im Blick zu behalten. Im Zentrum dieser Arbeit steht die Nutzung metabolisch strukturierter Stoffwechselmodelle zur Identifikation optimaler Kombinationen von gentechnischen Veränderungen. Mathematisch ist diese Designaufgabe als Optimierungsproblem formuliert, bei dem die Zielfunktion eine ausgewählte Produktionsrate darstellt. Dem Systemcharakter des Stoffwechsels wird auf zwei Weisen Rechnung getragen. Erstens wird bei jeder Optimierung das gesamte mathematisch abgebildete Stoffwechselnetzwerk berücksichtigt, zweitens wird durch die gleichzeitige Optimierung mehrerer Designparameter das Wechselspiel unterschiedlicher Eingriffe berücksichtigt. Als Beispielsystem wurde die Tryptophansynthese durch Escherichia coli gewählt. Bezüglich der Formulierung mathematischer Stoffwechselmodelle werden im Rahmen dieser Arbeit zwei unterschiedliche Ansätze verfolgt, wodurch sich eine Gliederung der Arbeit in zwei Teile ergibt. Im ersten Teil wird ein Modell untersucht, bei dem enzymkinetisch detailliert beschriebene Reaktionsraten verwendet werden. Einzelkinetiken werden verknüpft über die Bilanzen einer durch den Bilanzrahmen festgelegten Anzahl an Metaboliten. Der hier gewählte Bilanzrahmen ist für Modelle dieser Art bereits beachtlich und umfasst mit Glucoseaufnahme, Embden-Meyerhof-Parnas-Weg und Pentosephosphatweg wesentliche Teile des Glucosekatabolismus, sowie vereinfachte Ansätze für die Synthesewege von Chorismat und Tryptophan. Anhand dieses Modells wird eine Analyse der Flusskontrollkoeffizienten sowie eine nichtlineare numerische Optimierung der Tryptophansyntheserate durch Umverteilung von Enzymmengen durchgeführt. Es lässt sich zeigen, dass eine Untersuchung der Flusskontrollkoeffizienten wertvolle Hinweise zu einer Vorauswahl vielversprechender Eingriffsgrößen liefert, die Optimierung des Systems jedoch nicht ersetzen kann. Die kombinierte Optimierung von Teilsystemen stellt sich einer Optimierung des Gesamtsystems als eindeutig unterlegen heraus. Dadurch wird die gängige Praxis des sequenziellen Designs einzelner Stoffwechselwege in Frage gestellt. Auf den Aspekt von Wechselwirkungen zwischen Designparametern wird insbesondere bei der schrittweisen Entfernung von Ratenlimitierungen im Modell eines Hochleistungsstamms näher eingegangen. Mit der verstärkten Versorgung der Synthesewege mit PRPP und DAHP wird das Zusammenspiel zweier wegen der gemeinsamen Kohlenstoffquelle konkurrierender Designansätze in Bezug auf eine optimale Auslegung des Gesamtsystems untersucht. Eine wesentliche Schwäche des im ersten Teil der Arbeit untersuchten Modells stellt das Fehlen von Bilanzen für die Energie-Cometabolite und Reduktionäquivalente dar. Diese Größen lassen sich erst bei deutlich erweitertem Bilanzrahmen adäquat beschreiben. Ansätze für ein dynamisches Modell, das eine Bilanzierung dieser Größen zulässt, werden vorgestellt. Insbesondere die Verwendung eines vereinheitlichten Ansatzes für die Kinetik von Einzelenzymen wird anhand verschiedener publizierter Ansätze diskutiert. Hierbei lassen sich die Vorteile der Linlog-Kinetik gegenüber anderen einheitlichen Ansätzen herausstellen. Ansätze zur Identifikation der Parameter für Modelle, die die Linlog-Kinetik als einheitlichen kinetischen Ansatz für die Beschreibung von Einzelreaktionsraten verwenden, werden diskutiert. Ein formaler Ansatz zur Optimierung reiner Linlog--Modelle wird vorgestellt, der aber gerade für große Systeme und bei der Berücksichtigung von Nebenbedingungen Nachteile gegenüber der numerischen Optimierung aufweist. Die vorliegenden Ergebnisse unterstreichen eine Konsequenz aus dem Zusammenwirken der Einzelkomponenten eines Stoffwechselsystems, nämlich die mögliche Diskrepanz zwischen der Optimierung eines Teilsystems und einer Optimierung des gesamten Prozesses. Durch die große Bedeutung der Wechselwirkung unterschiedlicher Stoffwechselwege wird eine Erweiterung des Bilanzrahmens bis hin zu genomweiten Modellen motiviert.

Microorganisms are complex metabolic systems where properties of the whole system exceed the properties of its parts. Therefore, beneficial targets for strain improvement may not be discovered intuitively in many cases. This thesis addresses the use of dynamic, metabolically structured models in the identification of optimal enzyme amount manipulations. Mathematically, this design problem is expressed here as an optimization problem with a selected production rate as objective function and enzyme amounts as design parameters. Tryptophan synthesis in Escherichia coli serves as an example system. In this thesis, two different approaches for the mathematical description of metabolic systems are applied, dividing the thesis into two parts. The first part addresses a model which uses detailed enzyme kinetic descriptions of reaction rates. Individual reaction rates are coupled by a set of metabolite balances which is defined by the system boundaries. The model examined here includes glucose uptake, Embden-Meyerhof-Parnas-pathway and pentose phosphate pathway, as well as a simplified approach for the dynamics of the anabolic pathways leading to chorismate and tryptophan. For this model, flux control coefficients are investigated, and a nonlinear numerical optimization is performed. Flux control coefficients can be shown to point at promising design parameters, but can not replace optimization. A combination of changes in different enzyme amounts from the optimization of subsystems leads to a result inferior to that obtained by an optimization of the whole system, questioning the established procedure of optimizing individual pathways sequentially. For the model of an overproducing strain, the interaction between the demand for different precursors that are derived from the same substrate is highlighted. The importance of interactions between different pathways in the design of metabolism motivates an extension of model boundaries to the point of genome scale models. Especially cometabolites for the transfer of energy and reduction equivalents may only be described appropriately by larger models. The second part of this thesis addresses approaches that allow for an efficient model extension using a structurally unified kinetic approach for all individual rate equations. On this behalf, advantages of the linlog kinetic approach over other published approaches are pointed out, as well as some of its limitations. The identification of parameters and parameter accuracy for a model consisting only of rate equations with linlog kinetic structure is discussed.