Modellgestützte Entwicklung eines mehrstufigen Verfahrens zur enzymatischen Synthese enantiomerenreiner Aminosäuren

Abstract

Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines vollständigen Verfahrens zur Synthese von enantiomerenreinen L-Aminosäuren durch Biotransformation mit immobilisierten Enzymen. Als Modellsystem wurde die zweistufige Hydrolyse von D,L-Benzylhydantoin über L-Carbamoylphenylalanin zu L-Phenylalanin gewählt. Die erste Stufe wurde durch das enantioselektive Enzym Hydantoinase katalysiert und die zweite durch das enantiospezifische Enzym L-Carbamoylase.

Ein Schwerpunkt war die Analyse und Modellierung des gegebenen Reaktionssystems, das die reversible Reaktion von D- bzw. L-Benzylhydantoin zu D- und L-Caramoylphenylalanin, die irreversible Reaktion von L-Carbamoylphenylalanin zu L-Phenylalanin sowie die Racemisierung des Substrats Benzylhydantoin umfasste. Die Parameter in den enzymkinetischen Gleichungen wurden aus Anfangsreaktionsraten und zeitlichen Konzentrationsverläufen abgeschätzt. Da in einer Versuchsanlage an poröse Partikel immobilisierte Enzyme Verwendung fanden, wurden die enzymkinetischen Modelle um Gleichungen für den externen Transport der Reaktanten an die Partikeloberfläche und den internen Transport in den Partikeln erweitert. Die Racemisierung des Substrats Benzylhydantoin wurde mit zwei Modellen beschrieben, die sich in ihrem Detaillierungsgrad unterschieden. Während das erste Modell die Dissoziation des Benzylhydantoins berücksichtigte und die basenkatalysierte Racemisierung in wässriger Lösung von der Racemisierung an einem Ionenaustauscher differenzierte, vereinigte das zweite Modell die verschiedenen Mechanismen zu einer reversiblen Reaktion mit Hin- und Rückreaktion jeweils pseudo-erster Ordnung. Wichtigstes Ergebnis des detaillierten Modells war die Beschleunigung der Racemisierung durch Verschiebung des pH-Werts, wobei der durch Katalyse am Ionenaustauscher erzielte Geschwindigkeitszuwachs im Vergleich zur spontanen Reaktion exponentiell anstieg.

Auf der reaktionstechnischen Analyse bauten die Gestaltung einer Versuchsanlage im Labormaßstab und die Erstellung eines mathematischen Prozessmodells dieser Versuchsanlage auf. Mit Rücksicht auf die begrenzte Aktivität der Enzymimmobilisate und die geringe Löslichkeit des Benzylhydantoins wurde das Verfahren, welches drei Operationen umfasste, absatzweise betrieben: Auflösung von D,L-Benzylhydantoin in einem gerührten Membranreaktor, zweistufige enzymatische L-Phenylalanin Synthese in einem Festbettreaktor mit immobilisierter Hydantoinase und L-Carbamoylase sowie Racemisierung des nicht abreagierten Substrats D-Benzylhydantoin in einem zweiten mit starkem Anionenaustauscher gefüllten Festbettreaktor. Alle drei Apparate waren hintereinandergeschaltet und bildeten einen geschlossenen Kreislauf. Optional erfolgte eine nachgeschaltete Aufreinigung des Produkts L-Phenylalanin durch Elektrodialyse.

Im Vorfeld zu den experimentellen Arbeiten an der Versuchsanlage - und später auch diese begleitend - wurde ein mathematisches Modell des gesamten Verfahrens erstellt und mit Versuchsdaten parametriert. Dieses Modell bildete die Auflösung von festem Benzylhydantoin in einem ideal durchmischten Membranreaktor, die enzymatische Umsetzung im ersten und anschließende Racemisierung im zweiten Festbettreaktor sowie die Rückführung in den Membranreaktor ab. Bezüglich der Festbettreaktoren wurden die Stoffbilanzen getrennt für das Hohlraumvolumen sowie die porösen Partikel der Schüttung aufgestellt. Verkoppelt waren sie durch den Stoffübergang an der Oberfläche eines jeden Partikels. In den porösen Partikeln katalysierten die an der inneren Oberfläche immobilisierten Enzyme die im vorangehenden beschriebenen Reaktionen. Es resultierten hauptsächlich partielle Differentialgleichungen, die mit einem finite Volumen Verfahren (TVD) örtlich diskretisiert und dem numerischen Integrator LIMEX gelöst wurden.

Da die vollständige Umsetzung des racemischen Substrats D,L-Benzylhydantoin zum enantiomerenreinen Produkt L-Phenylalanin wesentlich von der Racemisierung abhing, kam dieser Umlagerungsreaktion eine zentrale Bedeutung zu. Es zeigte sich, dass eine Steigerung der Produktausbeute eine überproportionale Erhöhung der Ionenaustauschermasse erforderte. Andererseits bedeutete die Erhöhung der Ionenaustauschermasse einen zunehmenden Verlust an Produkt, da es durch Bindung an den Ionenaustauscher in der Reaktionslösung abgereichert wurde. Bezüglich des theoretisch möglichen Enantiomerenüberschusses von 100 % bei vollständiger Umsetzung des racemischen Substrats erwies sich beim gegebenen pH-Wert auch mit maximaler Racemisierungsgeschwindigkeit die langsame Rückreaktion von D-Carbamoylphenylalanin zu D-Benzylhydantoin als limitierend, und es resultierte ein maximaler Enantiomerenüberschuss von 64 %. Simulationsergebnisse belegten den vernachlässigbaren Einfluss der Auflösungskinetik des Benzylhydantoins auf das Gesamtgeschehen.

The aim of this work was to develop a complete process for the synthesis of optical pure L-amino acids by biotransformation with immobilized enzymes. Two-step enzymatic hydrolysis of D,L-benzylhydantoine via L-carbamoylphenylalanine to L-phenylalanine was employed as a model system. The first step was catalysed by an enantioselective hydantoinase and the second step by an enantiospecific L-carbamoylase.

A main focus was to analyze and model the given reaction system. It consists of a reversible conversion of D- and L-benzylhydantoine to D- and L-carbamoylphenylalanine, respectively, an irreversible conversion of L-carbamoylphenylalanine to L-phenylalanine and the racemization of the substrate benzylhydantoine. Parameters appearing in the kinetic rate equations were identified from experimentally obtained initial rates and time courses of concentration. Immobilized enzymes were utilized with a bench-scale pilot plant. Additional equations for external mass transfer at the surface of a particle and internal mass transport in a porous particle expanded the capability of the kinetic model to immobilized enzymes. Racemization of substrate benzylhydantoine was described with two models of different complexity. The first model included dissociation of benzylhydantoine and distinguished between general base catalytic racemization in aqueous solution and racemization at an ion exchanger. And the second model combined these different mechanisms to a single reversible reaction with forward and back reaction of pseudo-first order. An important result of simulations with the detailed model was an acceleration of the racemization rate by shifting the pH to higher values. In doing so the contribution of the catalytic ion exchanger exceeded the contribution of spontaneous racemization in an exponential way.

Both design of a bench-scale pilot plant and its mathematical modelling were based on the abovementioned analysis of the reaction system. Considering low activities of the immobilized enzymes and low solubility of benzylhydantoine batch operation of the process was favourable. It consisted of three units: dissolution of D,L-benzylhydantoine in a stirred membrane reactor, two-step enzymatic synthesis of L-phenylalanine in a fixed-bed reactor packed with immobilized hydantoinase and L-carbamoylase and racemization of non-converted substrate D-benzylhydantoine in a second fixed-bed reactor packed with a strong anion exchanger. All three units were connected in series and formed a closed cycle. Following the synthesis, an electrodialysis module was optionally used for purification of the product L-phenylalanine.

A mathematical model of the complete process was established prior to experimental work with the bench-scale pilot plant. It was modified together with the pilot plant and parameterized with experimental data. This model included the dissolution of solid benzylhydantoine in an ideally mixed membrane reactor, the enzymatic conversion in the first and following racemization in the second fixed bed reactor as well as the feedback into the membrane reactor. Concerning the fixed bed reactors the material balances were set up separately for bulk-fluid phase and particle phase. Both phases were coupled by the mass transfer at the surface of each particle. Immobilized enzymes at the internal surface of the porous particles catalyzed the reactions explained above. Basically this model consisted of partial differential equations which were spatially discretized using a finite volumes method (TVD) and solved with the numeric integrator LIMEX. Since complete conversion of racemic substrate D, L-benzylhydantoine to optically pure product L-phenylalanine depended substantially on racemization, this rearrangement reaction was of central importance. It was shown that maximizing the product yield required a disproportionately high increase of the ion exchanger mass. On the other hand the increase of ion exchanger mass meant a rising loss of product because it was depleted in the reaction solution by binding to the ion exchanger. Concerning the theoretically possible enantiomeric excess of 100 % after total conversion of the racemic substrate the slow back reaction from D-carbamoylphenylalanine to D-benzylhydantoine was proved as limiting at the given pH value also with maximum racemization rate, and it resulted a maximum enantiomeric excess of 64 %. Simulation results showed the negligible influence of dissolution kinetics of benzylhydantoine on the total reaction.