Dynamics of the preprotein translocase of the mitochondrial outer membrane

Abstract

The evolution of eukaryotic cells was accompanied by the acquisition of extensive internal membranes that enclose subcellular organelles. These dynamic membrane-bounded compartments contribute to growth and metabolism of the cell all in a unique manner. The mitochondria are organelles enclosed by two phospholipid membranes. Almost all mitochondrial proteins are encoded in the nucleus, synthesized in the cytosol, and are posttranslationally imported into the mitochondria. A key component of the mitochondrial import machinery is the TOM complex (translocase of the mitochondrial outer membrane).

The aim of this study was to gain more information on the dynamics displayed by this translocase that enables the translocation of a variety of preproteins either into or across the mitochondrial outer membrane.

In this study, I have optimized and developed protocols for the isolation of the TOM machinery from various mutants of the filamentous fungus Neurospora crassa. I have subjected the purified protein to various biophysical experiments such as 2-D and 3-D crystallization, fluorescence correlation spectroscopy, and electrophysiological measurements. Especially with the latter method, I was able to shed more light on the highly dynamic behavior of the TOM machinery. At least six distinct conductance levels existed between which the complex switched. Interestingly, these conductance states could be divided into two different classes. Two conductance levels existed that are consistent with the model of a cylindrical pore through which ions pass via diffusion. The I-V characteristics found with the other conductance levels, however, were more consistent with a diffusion over an energy barrier due to interactions of the ions with the pore wall. Furthermore, I gained evidence that Tom22 plays an important role for the transition between these different conformational states probably by reducing the energy required for this process. Finally, I present two models to explain the observed kinetic properties of the TOM machinery.

These results may serve as the basis for future studies in which the dynamics of the TOM machinery in the absence of preprotein, as presented here, can be compared with similar studies conducted in the presence of preprotein. The information gained from such experiments will allow us to understand the mechanism underlying the translocation of preproteins across the mitochondrial outer membrane at the biophysical level.

Die Evolution der eukaryotischen Zellen ist vor allem durch die Aneignung von umfangreichen internen Membranen, die subzelluläre Organellen umgeben, geprägt. Diese dynamischen Kompartimente tragen zum Wachstum und Stoffwechsel der Zelle bei. Die Mitochondrien gehören zu den Organellen, die von zwei Phospholipidmembranen umgeben sind. Die meisten mitochondrialen Proteine sind im Kern kodiert, werden im Zytosol synthetisiert und anschließend in die Mitochondrien importiert. Der TOM-Komplex, die Translokase der mitochondrialen Außenmembran, spielt dabei eine entscheidende Rolle. Alle mitochondrialen Proteine, die im Kern kodiert sind, müssen hier vorbei und werden entweder in die Au\ss enmembran eingebaut oder in den Intermembranraum transferiert. Die letzteren werden daraufhin zu den anderen Komponenten der Import-und Sortierungsmaschinerie geleitet. Für diese unterschiedlichen Aufgaben besitzt der TOM-Komplex eine dynamische Struktur und wechselt zwischen mehren Konformationszuständen. Ziel dieser Arbeit war es, diese Dynamik genauer zu untersuchen und zu charakterisieren.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden dafür bestehende Protokolle optimiert und neue etabliert, die zur Isolierung der TOM Maschinerie aus verschiedenen Mutanten des filamentösen Pilzes Neurospora crassa dienten. Mit dem aufgereinigten Material wurden anschließend verschiedene biophysikalische Studien durchgeführt. Zu diesen zählten 2-D und 3-D Kristallisation, Fluoreszenzkorrelationspektroskopie, sowie elektrophysiologische Studien. Vor allem mit der letzten Methode ist es gelungen, weitere Einblicke in die Dynamik von TOM zu gewinnen.

Es lagen mindestens sechs unterschiedliche Konformationszustände vor, die der TOM Kanal einnehmen konnte. Interessanterweise konnten diese Konformationszustände in zwei Populationen eingeteilt werden. Bei zwei Zuständen verhielt sich der Protein leitende Kanal wie eine zylindrische Pore. Die Porenöffnung war so groß, dass die passierenden Ionen die Einflüsse der Porenwand nicht spüren. Solche Kanäle weisen eine lineare Strom-Spannungskennlinie auf. Die Strom-Spannungskennlinie der anderen Population von Konformationszuständen deutete jedoch auf eine andere Situation hin. In diesen Konformationszuständen wurden die passierenden Ionen von der Porenwand beeinflu\ss t. Sie mußten daher zuerst eine Energiebarriere überschreiten, um durch den Kanal zu gelangen.

Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das essentielle Protein Tom22 eine entscheidende Rolle bei dem Schalten zwischen diesen Konformationszuständen spielte. Mit den erzielten Ergebnissen konnten so zwei Modelle aufgestellt werden, die die hochkomplexe Dynamik der TOM Maschinerie beschreiben.

Diese Studie liefert die Grundlage für zukünftige Untersuchungen, bei denen die Dynamik der TOM Maschinerie in der Gegenwart von Präproteinen untersucht werden kann. Ein Vergleich mit der hier im Detail aufgeklärten Dynamik der Translokase ohne Präprotein wird es ermöglichen die Translokation von Proteinen über die mitochondriale Außenmembran auf einer biophysikalischen Ebene zu verstehen.