New insights into structure and function of type I collagen

Abstract

Collagen is one of the most abundant proteins in mammalians and strongly conserved throughout evolution. It constitutes one third of the human proteome and comprises three-quarters of the dry weight of human skin. It is widely accepted as a major structural component in animal body such as in bones, cartilage and skins. More and more studies have shown that, in addition to the structural function, collagens can induce or regulate many cellular functions and processes such as cell differentiation, cell motion, cell communication and apoptosis. Furthermore, its unique triple helix structure gained more attention since it is responsible for its high stability and biological function. Due to the high accessibility, Type I and Type III collagen are widely studied and frequently used as biocompatible materials in cell culture, tissue engineering and medical technology. Until now the understanding of the molecular mechanisms for collagen assembly is of great medical and also biotechnological importance. Here, large amounts of highly purified homogeneous Type I collagen have been obtained from rat tail tendon by a simple two-step purification involving extraction with 9 M urea followed by Superose 12 chromatography. This simple two step purification of Type I collagen is up-scalable. The yield is up to 95%. The product could be easily lyophilized and stored. AFM and SEM images showed a structure similar to natural collagen. This collagen was extensively characterized by different biochemical, physical and cell biological methods. Mass spectrometry identified only collagen Type I peptides indicating that the extracted collagen was homogeneous. The comparison between urea-extracted (UC) collagen and acetic acid-extracted collagen (AC) showed significant differences whereby the UC was not degraded or hydrolyzed as in acetic acid. Furthermore, tandem MS analyses showed some interesting post-translational modifications, which will result in new insights into collagen structure in vivo. The purified collagen was renatured quantitatively by dialysis against water to form triple-helices, as judged by UV-circular dichroism. The collagen dissolved in 8M urea exhibits a unique reversible aggregation behavior which is not affected by the presence of reducing agents. UV-circular dichroism analysis shows that collagen initiates triple helix formation at 4 M urea or below. This triple helix structure is comparable to that observed with synthetic collagen peptides. Cultures of a 3T3 mouse embryonic fibroblast cells incubated with urea-extracted collagen showed a higher motility than those grown with acetic acid-extracted collagen as judged by light microscopy and scanning electron microscopy. The real time PCR showed significant difference on transcriptional level and showed clearly up regulation of the genes involved in response to mechanical stress in AC but not in UC and reference culture in medium. All these results indicate a benefit of UC for biotechnological/biomedical applications. The urea-extracted collagen exhibits a unique reversible-aggregational phenomenon during gel filtration in 8 M urea. We could show that covalent bonds and cross-linkings are not involved. This observation and subsequently extensive mass spectrometric analyses led to a new model of triple-helical assembly and a hypothesis about the collagen export, which may offer some new insights into understanding of collagen structure and transport from cytosol to extracellular space. The results presented here have led to an industrial patent (patented on 04. 30th. 2008). A manuscript was submitted to FEBS J for publication.

Kollagen ist eines der abundantesten Proteine in Säugetieren und sehr stark konserviert. Es bildet ein Drittel des menschlichen Proteomes und macht Dreiviertel des Trockengewichts menschlicher Haut aus. Es ist weiter bekannt als wichtigster struktureller Bestandteil in Säugertieren wie z.B. in Knochen, Knorpel und Haut. Außer der strukturellen Funktion, hat Kollagen viele zelluläre Funktionen und ist in mehreren zellulären Prozessen wie Zelldifferenzierung, Zellbewegung, Zellkommunikation und Apoptose beteiligt. Seine einzigartige Triple-Helix-Struktur verleiht ihm hohe Stabilität. Wegen der leichten Zugänglichkeit, sind Typ I und Typ III Kollagen am besten erforscht und werden als biokompatible Materialien in Zellkultur, Tissue Engineering und Medizintechnik angewandt. Bis heute ist das Verständnis der molekularen Mechanismen für die Faltung und Anordnung des Kollagens im Gewebe von großem medizinischem und auch biotechnologischen Interesse. In dieser Arbeit wurde ein Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Typ I Kollagen aus Rattenschwanzsehnen etabliert. Dabei wird ein zweistufiger Reinigungsprozess mittels Extraktion mit 9 M Harnstoff und anschließender Superose 12 Chromatographie durchgeführt. Diese einfache Aufreinigung von Typ I Kollagen lässt sich die industrielle Produktion auch in größerem Maßstab aufbauen. Das Produkt kann lyophilisiert und dadurch gut lagerbar gemacht werden. AFM und SEM Aufnahmen zeigten eine natur-ähnliche Struktur des harnstoffisolierten Kollagens. Dieses Kollagen wurde mittels verschiedenen biochemischen, physikalischen und zellbiologischen Methoden charakterisiert. Massenspektrometrie hat nur Typ I Kollagen-Peptide identifiziert, damit die Reinheit des isolierten Kollagens nachgewiesen. Der Vergleich zwischen Harnstoff-extrahiertem (UC) Kollagen und Essigsäure-extrahiertem Kollagen (AC) zeigt signifikante Unterschiede. So hat das AC eine deutlich niedrigere Masse als UC. Dies kann auf partielle Hydrolyse oder enzymatischem Abbau während der Extraktion zurückzuführen sein. Tandem MS Analysen haben differentielle post-transnationale Modifikationen identifiziert, was einen neuen Einblick in Kollagenstruktur in vivo ermöglichen kann. Das in 8 M Harnstoff gereinigte Kollagen wurde durch Dialyse gegen Wasser quantitativ renaturiert. Diese Renaturierung wurde mittels UV-Zirkularem Dichroismus verfolgt. Dabei wurde die Bildung einer Triple-Helix bestätigt. Das in 8 M Harnstoff aufgelöste Kollagen zeigt ein reversibles Aggregationsphänomen. UV-Zirkulare Dichroismus-Analyse zeigt, dass Kollagen bei Konzentrationen kleiner als 4 M Harnstoff eine Triple-Helix Struktur bildet. Diese Struktur ist auch vergleichbar zur der Struktur von synthetischen Kollagen-Peptiden. Harnstoffextrahiertes Kollagen wurde auf seine Eignung für die Zellkultur untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die 3T3 Fibroblasten auf UC Kollagen eine höhere Motilität besitzen, als auf AC Kollagen. Die Analyse mittels real time-PCR zeigt die Unterschiede auf transkriptionale Ebene. Gene, die zuständig für Reaktion auf Stress sind, werden in 3T3 Fibroblasten auf AC im Vergleich zu UC induziert. Dies deutet auf ein erhöhtes Stress-Level bei AC Kollagen hin. Diese Ergebnisse können von Nutzen für biotechnologische/biomedizinische Anwendungen sein. Harnstoffextrahiertes Kollagen zeigt eine einzigartige reversible Aggregation in 8 M Harnstoff während der Gelfiltration. Dabei konnten keine kovalenten Bindungen und Quervernetzungen intra- und intermolekular festgestellt werden, selbst unter reduzierenden Bedingungen. Diese Daten und weitergehende massenspektrometrische Analysen führten uns zum Entwurf eines Modells für die Reversibilität der Assoziation der drei Kollagenketten (2xα1, 1xα2) sowie der Faltung an sich. Zusätzlich wurde eine Hypothese über den Exportmechanismus des Kollagens gewagt. Die vorliegenden Ergebnisse haben zu einer Patentmeldung geführt (Patent wurde am 30. 04.2008 erteilt). Eine Publikation wurde in FEBS J eingereicht.