Neue TRAIL-Varianten für die zielgerichtete Tumortherapie

Abstract

Die zielgerichtete Apoptoseinduktion in Tumorzellen durch proapoptotische Liganden der TNF-Familie wie TNF, CD95L und TRAIL stellt einen wichtigen, neuen Ansatz in der Tumortherapie dar. Da TRAIL wirksame Aktivität gegenüber Tumorzellen und nur minimale Effekte gegenüber nicht transformierten, normalen Zellen aufzeigt und die systemische Applikation gut verträglich ist, eignet sich dieser Ligand besonders für die Entwicklung eines neuen Behandlungskonzepts. Allerdings zeigen bestimmte rekombinant hergestellte TRAIL-Varianten neben ihrer antitumoralen Wirkung auch Wirkung auf Normalgewebe, z.B. hepatotoxische Aktivität, was mit dem Potential zur Bildung höhermolekularer TRAIL-Aggregate in Zusammenhang steht. Löslicher TRAIL in seiner trimeren Form weist dagegen tumorselektive Eigenschaften auf, ist aber auch durch eine relativ geringe zytotoxische Wirkung auf Tumorzellen gekennzeichnet, da er nur über den TRAIL-R1 Apoptose induziert. TRAIL-R2 hingegen wird durch membrangebundenen TRAIL oder durch löslichen TRAIL, der durch Antikörper auf der Zellmembran sekundär quervernetzt wurde, aktiviert. Bedeutend ist, dass TRAIL-R2 bei vielen Tumoren der dominant exprimierte TRAIL Todesrezeptor zu sein scheint. Erste Daten klinischer Studien mit TRAIL sind zwar sehr vielversprechend, weisen aber auch darauf hin, dass eine weitere klinische Entwicklung möglicherweise in der Kombination mit anderen antitumoralen Behandlungskonzepten liegt. Da viele Tumoren TRAIL resistent sind, ist in diesem Zusammenhang eine Sensitivierung – durch beispielsweise Chemotherapeutika - gegenüber der TRAIL-induzierten Apoptose unumgänglich, die wiederum auch nicht-transformierte Zellen gegenüber einer TRAIL-Wirkung sensitivieren kann. Dies zeigt auf, dass eine Optimierung der TRAIL Reagenzien hinsichtlich einer Verbessung der spezifischen, zielgerichteten Aktivität sehr wichtig ist. Um die selektiven, antitumoralen Eigenschaften von TRAIL zu verbessern, wurden in dieser Arbeit - durch die gentechnische Fusion mit Tumor-spezifischen scFvs - TRAIL-Fusionsproteine mit Spezifität für ErbB2 und FAP generiert. Des Weiteren wurde eine innovative Formatvariante des TRAIL, das so genannte (single-chain) scTRAIL hergestellt und charakterisiert. Der Vergleich des einzelkettigen scTRAIL zu konventionellem, homotrimerem TRAIL zeigte keine Unterschiede in der Bioaktivität und in der Stabilität (in vitro und in vivo) auf. Die Charakterisierung der Antigen-spezifischen Fusionsproteine scFverbB2-TRAIL und scFverbB2-F-scTRAIL zeigte, dass diese neuen Fusionsproteine in vitro und in ersten präklinischen Anwendungen die Anforderungen an ein zielgerichtetes Tumortherapeutikum erfüllten. Beide Proteine zeigten spezifische Bindung auf ErbB2-positiven Karzinomzelllinien (Colo205-Zellen) und zeigten in vitro eine erhöhte, Antigen-abhängige Bioaktivität, wobei sich das einzelkettige scFverbB2-scTRAIL-Molekül durch die höchste Aktvität auszeichnete. Es konnte ebenfalls in vitro gezeigt werden, dass über die ErbB2-spezifische Bindung an die Zielzellmembran das TRAIL-Fusionsprotein Membran-TRAIL Bioaktivität nachahmt, was über eine effiziente Aktivierung des TRAIL-R2 nachgewiesen werden konnte. Dieses Konzept der zielgerichteten Apoptoseinduktion konnte durch die in vitro Charakterisierung weiterer TRAIL-Fusionsproteine mit Spezifität für FAP unterlegt werden. Im in vivo Xenotransplantationsmodell (humanes Kolonkarzinom205 in NMRI nu/nu Mäusen) wurden schließlich die verbesserten antitumoralen Eigenschaften der hier in der Arbeit entwickelten ErbB2-spezifischen TRAIL-Varianten unter Beweis gestellt. Auch in diesen in vivo Experimenten zeichnete sich das einzelkettige, ErbB2-spezifische TRAIL-Molekül durch die höchste Aktivität aus. Zusammenfassend belegen diese „proof of concept“-Studien in vitro und in vivo die sehr gute antitumorale TRAIL-Aktivität, wobei die Apoptose-Induktion durch die Tumorantigen-spezifischen TRAIL-Varianten noch verstärkt werden konnte. Dementsprechend repräsentiert dieses Design-Konzept eine sehr vielversprechende Strategie zur Verbesserung der antitumoralen TRAIL-Wirkung bei gleichzeitiger Minimierung von potentiellen Nebenwirkungen gegenüber nicht-transformierten Zellen.

Homotrimeric soluble TRAIL is currently been clinically exploited as cancer therapeutic, but shows little antitumoral activity in monotherapy. In an attempt to further improve TRAIL's tumor selective activity we generated new TRAIL fusion proteins comprising an antibody fragment (scFv) for targeting ErbB2. Further, a variant was designed, where TRAIL is expressed as a single polypeptide chain (scTRAIL). Apoptotic activity of scTRAIL is equivalent to a homotrimeric TRAIL molecule. We compared tumor targeting and apoptosis induction of scTRAIL based and of conventional, homotrimeric TRAIL fusion proteins with nontargeted TRAIL. Interestingly, among the tested TRAIL molecules, the tumor antigen targeted scTRAIL fusion protein showed highest apoptotic activity in vitro. The underlying mechanisms of this difference in apoptotic activity will be discussed. Data from a mouse tumor model with xenotransplanted Colo 205 cells also pointed to the highest antitumor activity for the erbB2 specific scTRAIL. Superior apoptosis induction of targeted TRAIL molecules represent a promising strategy to improve TRAIL's anti-tumoral action and minimizes potential non-targeted actions on normal tissues.