Protein kinase D (PKD) mouse models – towards an understanding of the physiological role of PKD

Abstract

The three members of the protein kinase D (PKD) family, PKD1-3, have been identified as serine/threonine kinases with functions in fundamental cellular processes as diverse as adhe-sion and motility, proliferation and differentiation, membrane and protein trafficking, regula-tion of gene expression, apoptosis, and oxidative stress signaling. Numerous in vitro studies addressed cell context dependent activation and functional principles of the PKD isoforms. Thus, the molecular mechanisms of PKD regulation and functions are well understood today. However, research about the role of PKD family members in vivo is still in its infancy. Due to its structural characteristics PKD3 is supposed to play a unique role among the three isoforms. In this study, the expression pattern of PKD3 during mouse development was investigated by immunohistochemistry. The expression is differentially regulated throughout early embryogenesis and organogenesis. Compared to other isoforms PKD3 is expressed more ubiquitously, implicating distinct and non-redundant functions within the PKD family. To further elucidate the potential role of PKD in vivo, transgenic mice overexpressing dominant-negative PKD mutants in an inducible and tissue specific manner were generated. Several transgenic lines for each of the three isoforms were established, genetically characterized and analyzed concerning transgene inducibility, expression level, biodistribution, and subcellular localization. For PKD1 and PKD2 transgenic lines were identified to facilitate a considerable overexpression of dominant-negative PKD compared to endogenous PKD, which is required to create a "functional knockout". To identify potential phenotypes provoked by skeletal muscle-specific transgene expression the response of mice to voluntary wheel running was studied. The running performance of mice expressing dominant-negative PKD1 was significantly decreased compared to control mice. Analysis of skeletal muscle fiber type composition after voluntary wheel running revealed that exercise-induced muscle remodeling was blocked in animals with transgene expression. Therefore, our data clearly indicate for the first time in a physiological in vivo model that PKD plays a fundamental role in the regulation of exercise-induced skeletal muscle remodeling. Another functional consequence of transgene expression was observed in the brain. Overexpression of dominant-negative PKD1 in the hippocampus was found to interfere with neuronal Golgi morphology, a result which confirmed previous in vitro data. Together, these findings implicate a key role of PKD in the regulation of neuronal Golgi organization. We conclude that the newly established transgenic mouse model serves as a valuable tool for the analysis of PKD functions in a physiological context and is useful for further studies in this field.

Die drei Isoformen der Protein kinase D (PKD) Familie, PKD1-3, gehören zu den Se-rin/Threonin-spezifischen Proteinkinasen und regulieren vielfältige zelluläre Funktionen, wie beispielsweise Zelladhäsion und Zellbewegung, Proliferation und Differenzierung, Vesikelt-ransport, Genexpression, Apoptose und Reaktionen auf oxidativen Stress. Zahlreiche in vitro Studien beschäftigten sich mit den Prinzipien der Aktivierung und den Funktionen der PKD Isoformen mit der Folge, dass die molekularen Mechanismen der PKD Regulation heute in Grundzügen verstanden sind. Informationen über die Funktion der PKD-Isoformen im intakten Organismus (in vivo) sind allerdings kaum vorhanden. Aufgrund ihrer strukturellen Besonderheiten wird davon ausgegangen, dass PKD3 eine be-sondere Funktion unter den drei Isoformen ausübt. In der vorliegenden Studie wurde die Expression von PKD3 in der embryonalen Mausentwicklung mit immunohistochemischen Methoden untersucht. In der frühen Embryonalentwicklung und Organogenese wird die Expression von PKD3 differenziell reguliert. Im Vergleich zu den anderen Isoformen erfolgt die PKD3-Expression allerdings eher ubiquitär, was eine individuelle und nicht-redundante Genfunktion innerhalb der PKD Familie vermuten lässt. Um eine funktionelle Untersuchung von PKD unter physiologischen Bedingungen zu ermöglichen, wurden in dieser Arbeit außerdem transgene Mäuse hergestellt, in denen durch induzierbare und gewebsspezifische Überexpression dominant-negativer PKD-Varianten ein „funktioneller PKD-Knockout“ herbeigeführt werden kann. Für jede der drei Isoformen wurden transgene Mauslinien etabliert, genetisch charakterisiert und bezüglich der Induzierbarkeit, des Expressionslevels, der gewebsspezifischen Verteilung und der subzellulären Lokalisation der modifizierten Proteine analysiert. Für PKD1 und PKD2 wurden transgene Mauslinien identifiziert, die eine deutliche Überexpression der dominant-negativen PKD Isoformen im Vergleich zum endogenen PKD Expressionslevel ermöglichen. Dies ist eine Voraussetzung für die Erzeugung eines "funktionellen PKD-Knockouts". Um potentielle phänotypische Effekte, die durch Skelettmuskel-spezifische Transgenexpression hervorgerufen wurden, zu untersuchen, wurde das Verhalten der Mäuse in Laufradexperimenten analysiert. Es zeigte sich, dass die Laufleistung von Mäusen, die dominant-negatives PKD1 Protein exprimieren, im Vergleich zu Kontrollmäusen signifikant reduziert ist. Desweiteren zeigten Analysen der Fasertyp-Zusammensetzung, dass in Tieren mit Transgenexpression die Remodellierung des Muskels, welche normalerweise durch Training induziert wird, blockiert ist. Somit implizieren unsere Daten eine entscheidende Funktion von PKD in der Regulation dieses physiologischen Vorgangs.