A combinatorial engineering approach to increase the productivity of CHO cells, and proteomic analysis of cell culture supernatant

Abstract

The optimization of production processes for therapeutic antibodies is a continuing challenge in pharmaceutical biotechnology. It has been demonstrated that vector design and host cell engineering can improve transcriptional and translational efficiency, resulting in the generation of high producer cell lines. However, the introduction of transgenes into production cell lines that regulate protein transport or affect post-translational modifications have been reported in the literature to lead to inconsistent results regarding the improvement of industrial processes. The present study shows that heterologous expression of the spliced form of transcription factor X-box-binding protein 1 (XBP-1(s)) leads to an increase in ER content in adherently growing Chinese hamster ovary (CHO) cells. Furthermore, specific therapeutic antibody productivity was elevated by 60% in CHO cells grown in inoculum suspension cultures. This dose-dependent effect translated into significantly increased overall antibody titers in a fed-batch format where cells were grown in chemically defined serum-free media. Protein-A purified antibody products from mock cells and XBP-1 transfected cells were found to be of comparable quality with regard to glycosylation pattern and physicochemical characteristics. The data demonstrated the potential of XBP-1 engineering to improve mammalian cell culture production processes to yield high amounts of a therapeutic protein product of desired quality. However, only low numbers of cells expressing the transgene at high levels were found during the generation of stable cell lines. Additionally, XBP-1(s) expression in monoclonal cell lines was found to decrease over a prolonged period of seed-stock cultivation. These observations were verified by colony formation assays (CFA) where XBP 1(s) expression led to significantly lower colony counts. In an additional experimental setting it was demonstrated that XBP-1(s) expression enhanced apoptosis in CHO cells. Altogether, the data demonstrated a survival disadvantage upon XBP-1(s) overexpression in engineered CHO cells, hampering a possible commercial cell line development program based on XBP-1 engineered cells. To overcome the XBP-1(s) mediated apoptosis, co-expression of the anti-apoptotic protein x-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) and XBP-1(s), combining secretion engineering and anti-apoptosis engineering, was evaluated. The proof-of-concept was demonstrated by colony formation assays (CFA), where concomitant XIAP and XBP-1(s) expression was able to restore colony counts. Moreover, when an mAb-producing CHO cell line was engineered, the bicistronic overexpression of both transgenes showed highest specific productivities and final titers in fed-batch cultures of polyclonal cell lines when compared with control cells. The data demonstrated a path toward optimized mammalian production processes. However, despite the proof-of-concept for the two transgenes approach on a pool level it proved challenging to transfer this idea from a model system to the final stages of industrial cell line development.

An additional building block for reproducible high-yielding production processes is sophisticated process monitoring. To be able to identify marker proteins which as a result of their concentration can indicate, for example, transitions between process phases during a production run, an analytical method was developed to investigate changes in the proteome of cell culture supernatant samples. In this approach, the proteome of the supernatant was analyzed by differential two-dimensional gel electrophoresis (2D-DIGE). In order to eliminate interfering effects of the protein product of producer cell lines on the separation method, a mock cell line was generated. This mock cell line was selected to closely simulate production processes with comparable cellular growth characteristics but without product formation. For the concentration of supernatant samples precipitation and ultrafiltration were compared and the filtration method was finally selected. A first analysis of supernatant samples derived from three different process times of a batch culture demonstrated the applicability of the method to separate and finally identify proteins with different abundance in process supernatant samples - a prerequisite for possible process marker proteins. Furthermore, the results of this first study were verified by Western blot analysis for one protein. The established method based on separation of the proteins from the supernatant by 2D-DIGE and subsequent identification by peptide mass fingerprinting using mass spectrometry can now be used as a starting point for further characterization studies. The identification of such process marker proteins is the first step toward next-generation bioprocess monitoring and control and provides an opportunity for further improved high-yielding production processes.

Die Verbesserung von Produktionsprozessen zur biotechnologischen Herstellung therapeutischer Proteine ist und bleibt eine ständige Herausforderung. Durch den Einsatz von optimierten Expressionsvektoren und die gezielte genetische Veränderung von Zellen auf den Ebenen der Transkription und Translation konnten deutliche Prozessverbesserungen erzielt werden. Dennoch waren zu Beginn des Projektes aus der Literatur keine eindeutigen Ergebnisse bekannt die belegen, dass der gezielte genetische Eingriff in die Post-translationale und Transportmaschinerie der Zelle zu einer weiteren Steigerung der Ausbeute führen kann. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Überexpression des humanen Transkriptionsfaktors X-box-binding protein 1 (XBP-1) in Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) zu einer Erweiterung des endoplasmatischen Retikulums führte. Ausserdem konnte die spezifische Produktivität von in Suspension wachsenden monoklonalen Antikörper (mAb) produzierenden CHO-Zellen durch heterologe Expression der gesplicten Form des Transkriptionsfaktors X-box-binding protein 1 (XBP-1(s)) um 60% verbessert werden. Dies führte auch in einem Fed-batch Produktionsprozess zu deutlich gesteigerten Antikörperausbeuten. Eine Analyse der Produktqualität zeigte keinerlei Veränderungen in Bezug auf das Glykosilierungsmuster und die physikochemischen Eigenschaften des produzierten monoklonalen Antikörpers. Damit konnte gezeigt werden, dass eine gezielte genetische Veränderung von Produktionszellen durch Engineering des Endoplasmatischen Retikulums zu verbesserten Prozessausbeuten führen kann. Während dieser Evaluierung wurden jedoch auch negative Einflüsse der XBP-1 Überexpression beobachtet. Diese Beobachtungen wurden anhand eines Koloniebildungstests überprüft. Deutlich geringere Koloniezahlen nach XBP-1 Überexpression bestätigten einen vermuteten Überlebensnachteil der Zellen durch die gezielte genetische Veränderung. Darüber hinaus konnte in einem weiteren Versuchsansatz gezeigt werden, dass die Überexpression von XBP-1 in CHO Zellen zu erhöhter Apoptose führt. Daher wurde versucht, durch die gemeinsame Expression des anti-apoptotisch wirkenden Proteins x-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) zusammen mit XBP-1 dessen bereits gezeigte, negative Einflüsse zu kompensieren. Einen ersten Hinweis auf einen möglichen Erfolg dieses Ansatzes wurde erreicht, indem in Koloniebildungstests eine Koexpression beider Proteine zu höheren Koloniezahlen führte und damit der negative Einfluss der XBP-1(s) Expression ausgeglichen werden konnte. Des Weiteren wurde ausgehend von einem antikörperproduziereden Produktionsklon gezeigt, das auf Ebene von polyklonalen Zelllinien die kombinierte Expression beider Proteine zu einem verbesserten Prozess mit gesteigerter Ausbeute führt. Die Daten zeigen, dass es prinzipiell möglich ist, Prozesse durch die kombinierte Expression von anti-apoptotischen und sekretionssteigernden Proteinen zu verbessern.

Ein weiterer, wichtiger Baustein für einen stabilen Produktionsprozess für Biopharmazeutika ist eine ausgereifte Prozesskontrolle. Ein zusätzliches Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zu etablieren, mit deren Hilfe Proteine im Zellkulturüberstand identifiziert werden können, die als Marker für bestimmte Prozessphasen dienen können. Hierzu sollte das Proteom im Zellkulturüberstand von Prozessen mit Hilfe der differenziellen zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D-DIGE) untersucht werden. Um den Einfluß des Protein-Produktes von Produktionszellen auf die Proteintrennung der Methode zu eliminieren, wurde zuerst eine Modellzelle generiert. Diese zeigte die gleichen Wachstumseigenschaften wie Produktionszellen, ohne dabei ein Therapeutikum zu produzieren. Im Folgenden wurden verschiedene Wege getestet, um die Proteinkonzentration im Zellkulturüberstand zu erhöhen und schließlich wurde eine Ultrafiltrationsmethode ausgewählt. Für einen ersten Test des gesamten Analyseverfahrens wurden anschliessend Überstände von verschiedenen Prozesstagen eines Batch-Prozesses mit Hilfe der 2D-DIGE Methode analysiert. Mittels Massenspektroskopie konnten dabei Proteine identifiziert werden, die zu den verschiedenen Messzeitpunkten in unterschiedlichen Konzentrationen vorlagen, was die Voraussetzung für mögliche Prozessmarker darstellt. Anhand eines Proteins wurde das Ergebnis dieser Analyse mittels eines immunologischen Nachweises verifiziert und bestätigt. Damit konnte gezeigt werden, dass die in dieser Arbeit etablierte Methode für die Suche nach Markerproteinen im Überstand von biotechnologischen Prozessen geeignet ist. Sie kann somit als Grundlage für die weitere Charakterisierung des Proteoms im Überstand von Zellkulturprozessen herangezogen werden. Anhand möglicher identifizierter Markerproteine können so neue Verfahren zur Prozesskontrolle entwickelt werden, welche die Grundlage für weiter verbesserte Produktionsprozesse bilden.