Biothermodynamische Studien zur Adsorption monoklonaler Antikörper an chromatographischen Trennmaterialien

Abstract

Monoklonale Antikörper sind therapeutische Proteine mit großem Potential in der modernen Medizin. Für ihre kostenoptimierte Produktion und ein rationales Design der technischen Trennprozesse ist ein Verständnis der Zusammenhänge zwischen den Prozessparametern, den Vorgängen in der Proteinlösung und dem Adsorptionsvorgang notwendig. In der vorliegenden Arbeit wurden systematisch thermodynamische Untersuchungen zum Adsorptionsvorgang zweier monoklonaler Antikörper an CEC-Trennmaterialien sowie einige erste Untersuchungen an HIC-Trennmaterialien durchgeführt. Für die CEC-Trennmaterialien wurden in Batch-Experimenten Gleichgewichts-Adsorptionsisothermen bei unterschiedlichen pH-Werten, Salzkonzentrationen und unterschiedlichen Adsorbermaterialien aufgenommen. An diese Gleichgewichtsdaten wurden Modelle aus der Literatur angepasst. Zur reinen Korrelation der Meßwerte wurde sowohl das Langmuir-Modell als auch das Langmuir-Freundlich-Modell verwendet. Beide Modelle wurden verglichen und bewertet. Das Langmuir-Freundlich-Modell liefert erwartungsgemäß eine bessere Anpassung der Daten. Für die thermodynamische Betrachtung ist es jedoch aufgrund unphysikalischer Aussagen über den Zustand unendlicher Verdünnung ungeeignet. Zur Beschreibung der Abhängigkeit der Proteinadsorption von der Salzkonzentration wurden das steric mass-action (SMA) und das available area Modell (AA) bewertet. Beide liefern ähnliche Ergebnisse. Bei pH-Werten nahe dem isoelektrischen Punkt der Antikörper konnte die Abhängigkeit der Adsorption von der Salzkonzentration mit diesen Modellen sehr gut beschrieben werden. Die aus der Anpassung erstellten Modellparameter lassen sich physikalisch sinnvoll interpretieren. Die Antikörpernettoladung ist hier gering. Bei hohen Antikörperladungen, d.h. pH-Werte, die deutlich vom pI abweichen, treffen wesentliche Annahmen beider Modelle nicht mehr zu, sodass sich keine sinnvollen Korrelationen mehr erzielen lassen. Zusätzlich wurden in der Arbeit unterschiedliche Methoden zur Bestimmung der SMA- Modellparameter vorgestellt und untersucht. Einerseits können die Parameter durch Anpassung an Gleichgewichtsisothermen, andererseits direkt aus Chromatographieläufen bestimmt werden. Es zeigte sich eine sehr gute Übereinstimmung. Eine weitere Methode, um die thermodynamischen Grundlagen des Adsorptionsmechanismus zu untersuchen, ist die Mikrokalorimetrie. Durch Experimente mit einem isothermen Titrationskalorimeter konnte in Verbindung mit den Ergebnissen der Adsorptionsisothermen die spezifische Adsorptionsenthalpie als wichtige thermodynamische Größe bestimmt werden. hasd ist sowohl vom Beladungszustand des Adsorbers, als auch vom pH-Wert der Pufferlösung abhängig. Entlang der Isotherme ist hads nicht konstant und nimmt betragsmäßig ab. In Abhängigkeit der Adsorberbeladung adsorbieren die Antikörper auf unterschiedliche Art und Weise und nehmen andere Konformationen bzw. Orientierungen ein. Während bei neutralen pH-Werten hads negativ ist, ist die Adsorption im Sauren dagegen endotherm und entropisch getrieben, verursacht durch den großen Einfluss der Ionenwolke und den bei der Adsorption im Sauren verursachten Entropiegewinn. Die Kombination aus kalorimetrischen Experimenten und Adsorptionsisothermen ermöglicht eine Berechnung der thermodynamischen Parameter der Adsorption gads, hads,sads und Keq . Im Rahmen dieser Arbeit dienten statische Laserlichtstreumessungen zur Untersuchung der Wechselwirkungen der gelösten Antikörper. Dabei wurde der zweite osmotische Virialkoeffizient A2 sowie die massengemittelte Molmasse Mw ermittelt. Bei den Messungen wurden der pH-Wert, die Salzkonzentration und die Salzart variiert. Mit steigender Salzkonzentration nimmt der A2 ab und für hohe Salzkonzentrationen wird er negativ, da starke anziehende Wechselwirkungen überwiegen. Die Lichtstreumessungen wurden nach zwei unterschiedlichen Methoden durchgeführt. Zum einen im Batch-Modus (SLS-Batch-Modus) und zum anderen im online Modus bei dem ein Laser-Detektor in ein HPLC-System mit SEC-Säulen integriert ist (online SLS-SEC-Modus). Beide Methoden zeigen konsistente Resultate. Zur Auswertung wurden in beiden Fällen selbst entwickelte Programme eingesetzt, die auf dem Debye-Plot basieren. Die online Bestimmung des A2 war mit der kommerziell erhältlichen Software bislang nicht möglich. Das entwickelte Programm ermöglicht nun die Bestimmung aus einer einzigen Injektion in die HPLC mit nur einer Proteinkonzentration. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass thermodynamische Untersuchungen einen Beitrag zum besseren Verständnis der Proteinadsorption und der Vorgänge sowie der Wechselwirkungen in Proteinlösungen liefern. Dieses Wissen und die hier vorgestellten Methoden und Ergebnisse stellt eine Grundlage dar, um optimale Aufreinigungsbedingungen für ein Protein zu finden.

Adsorption of therapeutic proteins on chromatographic materials is an attractive area of research which combines high academic challenges with the merits of working in an economically important and rapidly developing field. Downstream recovery of those high priced proteins is an important step in their production and high requirements on purity and aggregate content are imposed by health authorities. Protein adsorption on ion exchange (IEC) and hydrophobic interaction chromatographic (HIC) materials is extremely complex. The design of both separation methods is still based on trial and error by which the large number of process parameters like pH-value, type and quantity of salts have to be determined. Only a thorough understanding of the underlying physics and thermodynamics will allow a rational design of the technical process with its many interacting parameters. An interesting group of those therapeutic proteins are human monoclonal antibodies (hmAbs). Their importance in modern medicine is rapidly growing, because of their great potential to treat many different indications like autoimmune diseases or even cancer. For a successful design of a chromatographic protein separation with high yield and purities both the behaviour of the protein solution and the adsorption/desorption process have to be thoroughly understood. For this, the thermodynamic behaviour of the proteins under different buffer conditions is fundamental. The choice of suboptimal solution conditions can lead to less product yield, less protein solubility or even aggregates. This work extends the knowledge on thermodynamics of the adsorption of human monoclonal antibodies on cation exchange chromatographic (CEC) and HIC materials as well as the thermodynamic properties in solutions of monoclonal antibodies. The adsorption of two human monoclonal antibodies, which were supplied by an industrial partner, was studied with isothermal titration calorimetry (ITC) and by measuring equilibrium adsorption isotherms. Furthermore, solutions of the two hmAbs and of one mouse monoclonal antibody were studied with static laser light scattering (SLS). All relevant process parameters were systematically varied in the experiments. For the adsorption experiments with three different strong cation exchange resins and one hydrophobic resin the pH-value was varied between 4.5 and 7.0, using different buffer systems with different salt concentrations at 25°C. The equilibrium data were modelled using adsorption models from literature, like for example the Langmuir-model. Particular attention was paid to the modelling of the salt concentration which is a very important parameter for CEC. Therefore the steric mass-action (SMA) and the available area (AA) models were used and compared. Calorimetric techniques are useful for acquiring thermodynamic information on biological systems. ITC is the most important technique in that field. The advantage of ITC in the present application is its ability to directly monitor the adsorption process by detecting the heat released or taken up upon binding. The ITC data and the equilibrium adsorption isotherms allow determining the specific enthalpy of adsorption of the antibody hads. At pH-values near 7.0, where the antibodies are only weakly charged, the adsorption is exothermal. At small loadings the absolute number of hads is large and almost constant but it significantly decreases at higher loadings. This shows that the arrangement of antibody molecules on the absorber material depends on the loading and is less favourable at higher loadings. Despite the high positive charge of the antibody at pH-values of about 5.0 the value of hads is almost zero along the entire isotherm. Furthermore at pH 4.5 even endothermal effects were observed, although high binding capacities were found. At these conditions the adsorption process seems to be strongly influenced by the ions bound to the antibody. Their release upon adsorption explains the endothermal caloric effect. For the static laser light scattering (SLS) experiments the pH-value was varied between 4.5 and 10, as well as salt concentration of two different types of salt, namely sodium chloride and ammonium phosphate. From the results the second osmotic virial coefficient A2 and the mass-average molecular mass Mw were determined. Analysis of protein aggregates was performed with size-exclusion chromatography (SEC). At small pH-values and also small salt concentrations the A2 value is positive due to the positively charged antibodies and the resulting repulsive interactions. With increasing pH-values up to the isoelectric point a decreasing A2 was observed because of decreasing protein charge. At the isoelectric point there are attractive interactions which results in a poor solubility of the antibodies.