Die Rolle der mikrosomalen Epoxidhydrolase (mEH) im Mammakarzinom

Abstract

Antiöstrogene wurden in den letzten Jahren sehr effektiv in der Therapie des Mammakarzinoms eingesetzt. Im Verlauf der Therapie kann es jedoch zur Ausbildung von Tamoxifenresistenzen kommen, die den Ausgang negativ beeinflussen. Die funktionellen Mechanismen, die zur Entstehung dieser Resistenz führen, sind bisher noch weitgehend unbekannt. Grundlage dieser Arbeit ist eine Studie, in der gezeigt wurde, dass eine hohe Expression der mikrosomalen Epoxidhydrolase (mEH) zu einem schlechteren Verlauf der Tamoxifentherapie bei Patientinnen mit Mammakarzinom führt (Fritz et al. 2001). Dies wiederum lässt die Vermutung zu, dass eine erhöhte mEH-Expression zu einer Tamoxifenresistenz führen könnte. Eine funktionelle Analyse der möglichen Mechanismen hinter dieser Beobachtung könnte zu einem besseren Verständnis der Resistenzausbildung und somit zu möglichen neuen Therapieansätzen führen. Im ersten Teil der Arbeit wurden hormonsensitive MCF-7 Mammakarzinom Zelllinien eingesetzt, um den möglichen Einfluss der mEH auf die antiestrogen binding site (AEBS) zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass nach Behandlung mit Tamoxifen und dem AEBS-Inhibitor DPPE keine Änderung des Zellwachstums beobachtet werden konnte. Somit hat die mEH als Untereinheit der AEBS keinen Einfluss auf die Tamoxifenwirkung. Auf Grund der kompetitiven Wirkung von Östrogenen und Antiöstrogenen, könnte mEH die Tamoxifenbehandlung auf indirektem Weg über den Östradiol-(βE2-)signalweg beeinflussen. Um dies zu untersuchen wurde ein ERE-(estrogen response element)-Reportergenkonstrukt verwendet und die βE2-Antwort nach Behandlung mit Tamoxifen oder βE2 und Transfektion von mEH oder mEH_6C (verkürzte mEH, die durch ein früheres Stop-Codon kein aktives Zentrum beinhaltet) untersucht. Es zeigte sich eine Sensitivierung gegenüber βE2 nach Überexpression von mEH_6C. Des Weiteren konnte nach Inhibition der mEH mittels siRNA eine Hemmung der βE2-Antwort beobachtet werde. Analysen der mRNA von pS2 (βE2-Zielgen) und dem Östrogenrezeptor α (ERα) zeigten eine Inhibition in Abwesenheit der mEH. In einem weiteren, hormonell regulierten System, dem Corpusendometrium der Frau, sollte eine mögliche hormonelle Regulation der mEH innerhalb des Menstruationszyklus untersucht werden. Es zeigte sich nach Analyse der Paraffinschnitte eine signifikante Erhöhung der mEH-Expression im Verlauf des Zyklus. Während der Schwangerschaft erreichte diese ihren Höhepunkt. Da die mEH-Expression Ähnlichkeiten zur Progesteronexpression im Verlauf des Zyklus aufweist, wurde im Zellkultursystem eine mögliche Regulation der mEH durch Progesteron (Medroxy Progesteronacetat, MPA) untersucht. Anhand von zwei Endometrium-Zelllinien, der ERα-positiven (ERα+) ECC1PRAB-72 (PRA+, PRB+) und der ERα-negativen (ERα-) IKPRAB-36 (PRA+, PRB+) konnte gezeigt werden, dass MPA die mEH-Expression in Abhängigkeit des ERα hoch reguliert. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass mEH einen regulatorischen Einfluss auf die βE2-Antwort ausübt und gleichzeitig die mEH-Expression durch Progesteron reguliert wird. Somit scheint die mEH eine bis dahin noch unbekannte Funktion im hormonellen System auszuüben, die eine wichtige Rolle spielen könnte und möglicherweise einen neuen Ansatz zur Überwindung der Antiöstrogenresistenz des Mammakarzinoms liefern könnte.

Antiestrogens are used in treatment of breast cancer during the last years. In some cases resistance during treatment could arise, leading to a disprofit for the patient. The functional mechanisms of this resistance are still largely unknown. We have previously shown that high expression of microsomal epoxide hydrolase (mEH) is correlated with poor disease outcome in breast cancer patients receiving the antiestrogen tamoxifen [Fritz et al. 2001], suggesting that enhanced mEH expression could lead to tamoxifen resistance. In this study hormone responsive MCF-7 breast cancer cells were chosen as a model system to further elucidate the involvement of mEH on tamoxifen treatment. Furthermore, we used endometrial tissue samples to investigate the hormonal regulation of mEH. The results of these investigations should contribute to a better understanding of the mechanisms of antiestrogen resistance during breast cancer treatment. The first part of the study was focussed on the MCF-7 breast cancer cell line and the influence of mEH on tamoxifen treatment. Our results showed no significant effect of the antiestrogen binding site (AEBS) in the tamoxifen treatment of MCF-7 cells. The MCF-7 cell growth after co-treatment with Tamoxifen and the AEBS-inhibitor DPPE remained unchanged. A possible influence of mEH on antiestrogen treatment could be an enhancement of the estreogen response, because of the competitive interaction between estrogens and antiestrogens. Therefore, an estrogen response element (ERE-) reporter gene construct was used to analyze the estradiol-response under treatment with tamoxifen or estradiol (βE2) and overxpression of mEH or mEH_6C (C-terminal truncated mEH). The results showed a sensitizing influence of mEH_6C on the βE2 response but not full-length mEH. In contrast to these results, inhibition of the mEH expression via siRNA led to a repression of the βE2-response. Inhibition of the mEH expression resulted in a decrease of the mRNA level of pS2 (βE2-responsegene) and estrogen receptor α (ERα). Summarizing the first results, mEH seems to play a role during regulation of the βE2 signaling pathway. To better understand the role of mEH in hormone dependent tissue we investigated samples of the endometrial uterine corpus for immunohistological analysis of mEH resulting in the following expression pattern of mEH during the menstrual cycle: In the first half of the cycle mEH expression was low, increased during the second half and reached highest expression during pregnancy. Due to the similarity between the expression pattern of mEH and progesterone serum level we investigated the regulation of mEH expression in response to progesterone in human endometrial cell lines (IKPRAB-36: progesterone receptor positive (PRA+, PRB+) and estrogen receptor α negative (ERα-); ECC1PRAB-72: PRA+, PRB+ and ERα+) by Western Blot analysis and RT-PCR. In ECC1PRAB-72 (ERα+) we observed an increase of mEH expression after addition of medroxyprogesterone acetate (MPA), whereas in IKPRAB-36 (ERα-) MPA had no influence on mEH expression, suggesting that MPA regulation of mEH is dependent on ERα. In conclusion, we could show that the mEH has an influence on βE2 signaling, which could be of importance during tamoxifen therapy of breast cancer. In the second part we showed that the expression of mEH is regulated by progesterone in a classical hormone target tissue like the human endometrium. Although mEH is well characterized for detoxification of epoxides, our results suggest that mEH could also play an important role in the hormonal system.