The role of the deleted in liver cancer protein family in breast epithelial cell transformation

Abstract

Three genes of the human genome encode for a subfamily of Rho GTPase-activating proteins (RhoGAPs) termed "deleted in liver cancer" (DLC) proteins. Rho GTPases participate in a complex set of intracellular signaling pathways including the regulation of cytoskeleton dynamics and cell motility. Since RhoGAPs accelerate the transfer of active GTP-bound Rho proteins to the inactive state, they are able to attenuate signal transduction activities of Rho GTPases. In vitro the DLC proteins show GAP activity towards the Rho proteins RhoA and Cdc42 but not for Rac1. DLC proteins have furthermore been identified as binding partners for tensin proteins and localize to focal adhesions. As the name implicates, loss of DLC protein expression has been first observed in hepatocellular carcinomas. Meanwhile, their down-regulation has also been found in a variety of other human cancers, indicating a possible role for the three DLC family members as tumor suppressors. Studies with overexpressed DLC1-3 suggest that they share common cellular functions. Ectopic expression of DLC1, for example, has been shown to inhibit cell migration, proliferation, anchorage independent growth and even metastasis. However, whether the loss of DLC family members is the cause of aberrant Rho signaling in transformed cells has not been investigated. To elucidate the functions of endogenous DLC proteins we silenced DLC1-3 expression in breast cancer cell lines using a RNA interference (RNAi) approach and compared the cellular alterations. We demonstrate that the loss of each DLC family member leads to a distinct cellular phenotype. For instance, knockdown of DLC1 and DLC3 enhanced cell motility in transwell assays, but had a differential impact on random cell migration and RhoA activity. By contrast, DLC2 down-regulation failed to affect cell locomotion, although it led to an enhanced level of active RhoA. Furthermore, we provide data supporting the involvement of DLC1 in the control of directed cell migration through a Dia1- and not Rho kinase (ROCK)-dependent pathway. In summary, we show that despite their overlapping substrate specificity towards RhoA in vitro, DLC family members have non-redundant cellular functions. We assume that this is most likely due to their multimodular structures, distinct spatial distributions and interaction with different signaling proteins in intact cells.

Drei Gene des humanen Genoms kodieren für eine Unterklasse der Rho GTPase aktivierenden Proteine (RhoGAPs), die man als "deleted in liver cancer" (DLC) Proteine bezeichnet. Rho GTPasen sind an einer Reihe komplexer intrazellulärer Signalwege beteiligt, welche auch die Regulation von Zytoskelettveränderungen und die Zellmigration miteinschließen. Da RhoGAPs die Überführung aktiver GTP-gebundener Rho-Proteine in den inaktiven Zustand vermitteln, können sie die Signalgebung der Rho GTPasen vermindern. DLC-Proteine weisen in vitro GAP-Aktivität hinsichtlich der Rho-Proteine RhoA und Cdc42 auf, aber nicht für Rac1. Außerdem sind sie als Bindungspartner für Tensin-Proteine identifiziert worden und in fokalen Adhesionspunkten lokalisiert. Wie der Name impliziert, wurde der DLC-Expressionsverlust zuerst in Leberkarzinomen beobachtet. Mittlerweile wurde ihre reduzierte Expression auch in einer Vielzahl anderer humaner Krebsarten gefunden. Dies deutet auf eine mögliche Rolle der drei DLC-Familienmitglieder als Tumorsuppressoren hin. Studien mit überexprimierten DLC1-3 lassen vermuten, dass sie überlappende zelluläre Funktionen aufweisen. Es wurde gezeigt, dass die Expression von DLC1 die Zellmigration, die Proliferation, das Wachstum unabhängig von Matrixkontakten und selbst die Metastasenbildung unterdrücken kann. Ob allerdings der Verlust der DLC Familenmitglieder eine veränderte Rho-Signalgebung in transformierten Zellen bewirkt,wurde noch nicht untersucht. Um die Funktionen von endogenen DLC-Proteinen zu untersuchen, haben wir die DLC1-3 Expression in Brustkrebszelllinien mit Hilfe von RNA Interferenz ausgeschaltet und die zellulären Veränderungen verglichen. Wir konnten zeigen, dass der Verlust der einzelnen DLC-Familienmitglieder zu unterschiedlichen zellulären Phänotypen führt. So erhöhte sowohl der Verlust von DLC1 als auch von DLC3 die Zellmigration in Transwell Assays, allerdings ließen sich im Falle von ungerichteter Zellmigration und RhoA-Aktivität Unterschiede feststellen. Dem gegenüber steht DLC2, dessen Expressionsverlust nicht die Zellmigration beeinflusste, obwohl eine erhöhte RhoA-Aktivität zu beobachten war. Außerdem beweisen wir durch unsere Daten, dass DLC1 durch einen Dia1-abhängigen und ROCK-unabhängigen Signalweg an der gerichteten Zellmigration beteiligt ist. Zusammenfassend kann man sagen, dass DLC-Familienmitglieder, abgesehen von ihrer überlappenden Substratspezifiät hinsichtlich RhoA in vitro, individuelle zelluläre Funktionen aufweisen. Wir vermuten, dass dies auf ihren mehrmoduligen strukturellen Aufbau, ihre unterschiedliche subzelluläre Lokalisation und die Interaktion mit spezifischen Signalmolekülen zurückzuführen ist.